可溶性蛋白的测定——李合生

植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。

常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。

方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。

其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。

再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。

这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。

LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。

LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。

但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。

因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。

且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。

植物体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定摘要：目的通过标准曲线的绘制，测定白菜、芹菜、菠菜中可溶性蛋白和可溶性糖的含量，了解可溶性糖和可溶性蛋白的测定方法。

方法分别用蒽酮法和考马斯亮蓝染色法来测定植物体内可溶性糖和可溶性蛋白的含量。

结论关键词：白菜；芹菜；菠菜；可溶性蛋白含量；可溶性糖含量；蒽酮法；考马斯亮蓝染色法1 引言植物体内的可溶性糖和可溶性蛋白含量是重要的生理生化指标。

在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。

它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。

由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。

可溶性蛋白是植物体内氮素存在的主要形式，其含量的多少与植物的代谢和衰老有密切的关系，同时它与植物体维持渗透压抗脱水也有很大关系。

白菜是十字花科芸薹属叶用蔬菜，味道鲜美可口，营养丰富，素有“菜中之王”的美称，为广大群众所喜爱。

芹菜属伞形科植物，富含蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、B族维生素、钙、磷、铁、钠等，同时，具有有平肝清热，祛风利湿，清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。

菠菜藜科一年生草本植物，菠菜含有丰富的维他命A、维他命C及矿物质，它对各种贫血症和糖尿病、肺结核、高血压、风火赤眼等诸多疾病可起辅助治疗作用。

2 材料与方法2.1 植物体内可溶性糖含量的测定2.1.1材料新鲜的白菜、芹菜、菠菜叶片（剪碎后各取0.5—1.0g）2.1.2试剂葡萄糖标准溶液（200ug/ml)、蒽酮试剂2.1.3仪器设备分光光度计；分析天平；恒温水浴；试管；三角瓶；移液管；剪刀；玻璃棒；滤纸；研钵2.1.4测定方法样品中可溶性糖的提取：称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ～1.0 g （或干样粉5～100 mg ），放入大试管中，加入15 ml 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤入100 ml 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。

常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。

方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。

其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。

再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。

这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。

LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。

LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。

但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。

因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。

且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。

2.3 各项指标的测定方法2.3.1 生物学指标的测定于芥蓝菜薹采收期，每处理随机抽取6株，测定芥蓝生物学性状指标，包括株高，薹粗，节数，单株产量和叶面积。

2.3.1.1 株高测定菜薹长度为第一片真叶基部至生长点的距离，取平均值。

2.3.1.2 薹粗测定用游标卡尺测量第5与第6片叶之间的粗度，取平均值。

2.3.1.3节数和节间长度测定节数为第一片真叶基部起至生长点的节数，节间长度=株高/节数2.3.1.4 单株产量测定取第4节位以上植株进行测定，求单株鲜重。

2.3.1.5 蜡粉含量的测定参照Kumar.S方法测定（Kumar S，1987）。

将芥蓝叶片剪成条状，称取1.0g，放于培养皿中，用10ml氯仿浸泡30秒，取出叶片立即烘干。

将培养皿在室温下蒸发干燥，蜡粉含量为培养皿增重（mg/g）。

重复三次。

2.3.2 光和系统指标的测定2.3.2.1 叶面积的测定取第5片及以上共6片叶进行测定，求单株总叶面积。

采用Li-COR 公司生产的Li-3000A 型叶面积仪测量叶面积。

用直尺测量芥蓝叶片的长度（L，叶柄基部到叶尖的距离）和宽度（W，与主脉垂直的最大宽度），用Li- COR公司的Li- 3000A型叶面积仪测量实际叶面积（LA）。

用回归的方法建立实际叶面积与芥蓝叶片长乘以宽面积之间的回归方程，找出最佳回归系数。

2.3.2.2 比叶重测定于各处理中随机取10片叶子，用0.8mm打孔器，在叶片最宽处离主脉两侧的中心位置打孔，将10个小圆片放在烘样盒后在105℃杀青10min，再80℃烘至恒重。

比叶重=总叶干重/总叶面积(g/m2)2.3.2.3 叶绿素含量测定采用95%乙醇浸泡法（李合生，2000），称取剪碎的新鲜样品0.1g放入试管，用95%的乙醇15ml，在黑暗条件下浸泡24h，至叶片表皮变白，取上清夜在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。

计算公式：叶绿素a（mg/L）=13.95A665－6.88A649 （1）叶绿素b（mg/L）=24.96 A649－7.32A665 （2）类胡萝卜素（mg/L）=（1000A470-2.05C a－114.8C b）/245(1)、(2)相加即得叶绿素总浓度，在按照下式计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。

植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法更新时间2015-5-191、目的：测定植物组织的可溶性蛋白含量，测定范围为100-1000ug/ml，高浓度需要稀释后测定。

小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。

2、提取：用测定SOD （0.05M pH7.8磷酸缓冲液）或者POD （0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （pH6.0）的提取液或者用水提取均可，但混匀后要放置0.5-1小时再离心，以充分提取。

单独测定时，取样品5g，加水50ml，破碎，冷藏存储，测前10000rpm离心10分钟备用，取样0.1-0.2ml测定（如果加水比较少，计算时应考虑材料水分）。

3、测定：以提取液为对照，以牛血清标准蛋白为标准，以考马斯亮蓝G-250为显色剂，显色2-30分钟内，在595nm 比色。

4、计算：可溶性蛋白含量（ug/g鲜重）=测定含量（ug）*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。

5、试剂配制：5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取0.100g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液，此液不用时应冷藏保存，可用15天。

将1000μg／mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍，作为工作液，浓度为100μg／mL。

5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂：称取0.050g考马斯亮蓝G-250，溶于25mL95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸50mL，最后用蒸馏水定容到500mL。

此溶液在常温下可放置1个月。

标准曲线及样品配制表 蛋白含量（μg） 100μg/ml标准蛋白（μl） 提取液 （μl） 考马斯亮蓝G-250显色剂 （ml）0 0 10002.5 20 200 80040 400 600 60 600 400 80 800 200100 1000 0样品* X（一般叶片为1000） 1000-x*注1：样品量依据显色调整，生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定方法:考马斯亮蓝G－250染色法1.原理：考马斯亮蓝G－250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小,除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。

但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。

2.仪器：721分光光度计;10ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶;移液管；1ml3支;5ml3支；10ml 具塞刻度试管14支。

3.试剂:90乙醇％(无水乙醇20瓶以下8元1瓶,每瓶500ml)；85%磷酸（500ml磷酸标准溶液0。

1mol/ml，16元钱1瓶)；考马斯亮蓝G－250（80元钱1瓶，1瓶10g）；牛血清白蛋白。

考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250,溶50ml90％乙醇，85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。

4。

标准曲线的绘制4.1、0～100μg/ml标准曲线的制作:取6支试管，按表1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml.准确吸取所配各管溶液0。

1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G—250试剂，盖塞,反转混合数次，放置2min后,在595nm下比色，绘制标准曲线。

李合生. 植物生理生化实验原理和技术李合生（1921～2012），中国植物生理生化学家，被誉为我国植物生理学的奠基人之一。

他的研究成果及其对中国植物生理学发展的贡献不仅在学术界享有盛誉，而且对农业生产的实际应用产生了重大影响。

李合生对植物生理生化实验的原理和技术进行了大量的研究和实践，为植物生理学研究方法的创新和发展作出了重要贡献。

以下是关于李合生. 植物生理生化实验原理和技术的一些介绍。

一、植物生理生化实验原理1. 实验的目的和问题：在进行植物生理生化实验时，首先需要明确实验的目的和解决的问题。

研究植物光合作用的效率提高的方法，研究植物对环境胁迫的响应机制等。

2. 实验的设计和控制：植物生理生化实验需要精确的实验设计和严格的实验控制，以确保实验结果的可靠性和准确性。

实验因素的选取和处理、实验材料的选择和处理、实验条件的控制等。

3. 实验的方案和方法：根据实验的目的和问题，确定合适的实验方案和方法。

测定植物光合作用的速率可以选择光合速率仪、测定植物叶片的光谱特性可以使用光谱仪等。

二、植物生理生化实验技术1. 光合作用的测定：光合作用是植物生命活动的基础，测定植物的光合作用对于研究植物生理生化过程至关重要。

李合生在光合作用的测定方面进行了大量的研究，并开发了一系列的测定技术和仪器。

2. 植物代谢产物的测定：植物代谢产物的测定可以揭示植物的生物化学过程和物质代谢机制。

李合生研究了植物合成蛋白质的方法和代谢产物，提出了一系列的测定技术和方法。

3. 植物生长调控的实验技术：植物生长调控是植物生理生化过程的核心之一，实验技术的发展为植物生长调控的研究提供了有力的支持。

李合生在植物生长调控的实验技术方面做出了重要的贡献。

三、植物生理生化实验的应用李合生的植物生理生化实验原理和技术的应用不仅限于学术研究领域，还广泛应用于农业生产、食品工业等实际生产领域。

1. 农业生产：通过植物生理生化实验原理和技术，可以揭示植物在不同环境条件下的生长规律和适应机制，为农业生产中的种植技术、育种方法等提供科学依据。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定P127—130植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活（酶活力单位/毫克蛋白质，unit/mg protein）表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。

考马斯亮蓝G—250染色法原理：考马斯亮蓝G—250（Coomassie btilliant blue G—250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G—250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水微区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（1—100ug），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G—250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G—250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大），可测微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。

但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。

仪器与用具分光光度计；10ml量筒；研钵；烧杯；量瓶；移液管；刻度试管试剂：标准蛋白质溶液：用牛血清蛋白配成蛋白质100ug/ml（0.1mg/ml）的标准蛋白溶液；90%乙醇；85%磷酸（W/V）考马斯亮蓝G—250溶液：称取100ug考马斯亮蓝G—250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放1个月。

方法：1. 标准曲线（蛋白质含量为0—100ug/ml）的绘制取6支具塞试管，按表30—1数据配制含0—100ug/ml的牛血清蛋白质液各1ml。

可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）1. 试剂配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。

在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇，75%乙醇或取45ml 无水乙醇直接定容至50ml。

（2） 100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。

或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。

（3） mol/L，磷酸配制：A母液， mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO412H2O (分子量 g，用蒸馏水定容至500 ml。

B母液， mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O (分子量 g，用蒸馏水定容到50 ml。

磷酸：分别取A母液，B母液，用蒸馏水定容至1000ml。

2. 标准曲线绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

试剂0号1号2号3号4号5号标准蛋白体积/ml蒸馏水体积/ml蛋白质含量/g020*********3. 样品测定（1）样品提取：取鲜样—，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。

（2）吸取样品提取液（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。

4. 蛋白质含量计算可溶性蛋白含量（mg/g）=(C VT)/1000VS（mg/g）C—查标准曲线值，g；VT—提取液总体积，ml；WF—样品鲜重，g；VS—测定时加样量，ml。