实验28 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。

在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。

由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。

该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。

[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。

(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。

(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。

(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。

B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。

使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。

(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。

H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。

之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。

冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。

待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。

使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。

因此在使用前应进行标定。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。

常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。

方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。

其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。

再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。

这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。

LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。

LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。

但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。

因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。

且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。

植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法更新时间2015-5-191、目的：测定植物组织的可溶性蛋白含量，测定范围为100-1000ug/ml，高浓度需要稀释后测定。

小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。

2、提取：用测定SOD （0.05M pH7.8磷酸缓冲液）或者POD （0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （pH6.0）的提取液或者用水提取均可，但混匀后要放置0.5-1小时再离心，以充分提取。

单独测定时，取样品5g，加水50ml，破碎，冷藏存储，测前10000rpm离心10分钟备用，取样0.1-0.2ml测定（如果加水比较少，计算时应考虑材料水分）。

3、测定：以提取液为对照，以牛血清标准蛋白为标准，以考马斯亮蓝G-250为显色剂，显色2-30分钟内，在595nm 比色。

4、计算：可溶性蛋白含量（ug/g鲜重）=测定含量（ug）*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。

5、试剂配制：5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取0.100g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液，此液不用时应冷藏保存，可用15天。

将1000μg／mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍，作为工作液，浓度为100μg／mL。

5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂：称取0.050g考马斯亮蓝G-250，溶于25mL95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸50mL，最后用蒸馏水定容到500mL。

此溶液在常温下可放置1个月。

标准曲线及样品配制表 蛋白含量（μg） 100μg/ml标准蛋白（μl） 提取液 （μl） 考马斯亮蓝G-250显色剂 （ml）0 0 10002.5 20 200 80040 400 600 60 600 400 80 800 200100 1000 0样品* X（一般叶片为1000） 1000-x*注1：样品量依据显色调整，生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。

学生设计性实验论文题目：植物体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定姓名魏会会学号2012132119专业生物技术班级123班相关实验课程名称基础生物化学实验指导老师单树花实验学期2013~2014学年第二学期植物体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定摘要：目的通过标准曲线的绘制，测定白菜、芹菜、菠菜中可溶性蛋白和可溶性糖的含量，了解可溶性糖和可溶性蛋白的测定方法。

方法分别用蒽酮法和考马斯亮蓝染色法来测定植物体内可溶性糖和可溶性蛋白的含量。

结论关键词：白菜；芹菜；菠菜；可溶性蛋白含量；可溶性糖含量；蒽酮法；考马斯亮蓝染色法1 引言植物体内的可溶性糖和可溶性蛋白含量是重要的生理生化指标。

在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。

它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。

由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。

可溶性蛋白是植物体内氮素存在的主要形式，其含量的多少与植物的代谢和衰老有密切的关系，同时它与植物体维持渗透压抗脱水也有很大关系。

白菜是十字花科芸薹属叶用蔬菜，味道鲜美可口，营养丰富，素有“菜中之王”的美称，为广大群众所喜爱。

芹菜属伞形科植物，富含蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、B族维生素、钙、磷、铁、钠等，同时，具有有平肝清热，祛风利湿，清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。

菠菜藜科一年生草本植物，菠菜含有丰富的维他命A、维他命C及矿物质，它对各种贫血症和糖尿病、肺结核、高血压、风火赤眼等诸多疾病可起辅助治疗作用。

2 材料与方法2.1 植物体内可溶性糖含量的测定2.1.1材料新鲜的白菜、芹菜、菠菜叶片（剪碎后各取0.5—1.0g）2.1.2试剂葡萄糖标准溶液（200ug/ml)、蒽酮试剂2.1.3仪器设备分光光度计；分析天平；恒温水浴；试管；三角瓶；移液管；剪刀；玻璃棒；滤纸；研钵2.1.4测定方法样品中可溶性糖的提取：称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ～1.0 g （或干样粉5～100 mg ），放入大试管中，加入15 ml 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤入100 ml 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

植物体内可溶性蛋白含量的测定一目的：植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活力（酶活力单位/毫克蛋白质）表示酶活力的大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。

本实验用Folin—酚试剂法。

二原理：Folin—酚试剂法也称Lowry法，包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。

第二步是此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸（ Folin 试剂）还原，混合物深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。

因此，可利用其650nm波长下的特定吸收进行比色测定。

此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高 100 倍，定量范围为 5-100μg 蛋白质。

Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。

此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同。

三植物材料、仪器设备及试剂配制：（1）植物材料：100mg/L,300mg/L,500gm/L,700mg/L.以及0mg/L铅胁迫的黄瓜叶片（2）仪器设备：分光光度计、电子天平、离心机、生化培养箱、冷凝回流装置一套、玻璃研钵、移液管或移液枪、刻度试管、普通试管、玻璃棒、洗瓶、小烧杯等。

（3）试剂的配制：1、标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg/ml。

2、Folin-酚试剂甲：是由A和B两种溶液组成的。

A 液：称取10g 碳酸钠（Na2CO3）溶液与 2g 氢氧化钠（NaOH）和0.25g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）,用去离子水溶解并定容到500ml。

B 液：称取0.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液，用去离子水溶解并定容到100ml。

每次使用前将 A 液与 B 液按 50 ∶ 1 的比例混合即成。

植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白含量的测定一、目的衰老是植物在长期进化和自然选择中形成的一种生物学现象，它可以在植物的细胞、器官和整体等不同水平上表现出来。

植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。

另外自由基代谢失调并在体内积累也是植物衰老的机理之一。

本实验主要是测定植物衰老过程中叶片蛋白质的变化，掌握植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白的测定原理及方法。

二、原理植物材料经Tris－HCl缓冲液研磨、离心后，可溶性蛋白质溶于上清液中，非可溶性蛋白则存在于沉淀部分。

将沉淀用碱水解，则会得到非可溶性蛋白的提取液。

蛋白质提取液与考马斯亮蓝G－250反应呈蓝色。

在一定范围内，蛋白质的含量与反应液在595nm波长的吸光度呈正比，由此可求出蛋白质的含量。

三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴；研钵（或组织捣碎机）；试管；移液管；洗耳球等；3. 试剂及配制提取液（50mmol·L－1Tris－HCl，pH7.8，含0.5 mmol·L－1MgCl2， 1 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1二硫苏糖醇, 缩写：DTT）。

考马斯亮蓝溶液配制：称取考马斯亮蓝G－250 100mg，加95％乙醇50ml，和85％磷酸100ml，然后定容至1000ml。

0.15mol·L－1NaCl溶液牛血清蛋白标准母液配制:用0.15mol·L－1NaCl溶液配成100μg·ml－1牛血清蛋白标准液。

四、实验步骤1. 牛血清蛋白标准曲线的制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～100μg的牛血清蛋白标准液。

加入表中试剂后，摇匀，以0号管为空白对照，在595nm波长处测定其吸光度（A）值。

1.2标准曲线绘制以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 蛋白质的提取称取叶片0.3～0.5g，剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3ml，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成匀浆，匀浆倒入离心管中，再用5ml提取液（分两次）将研钵中匀浆洗入离心管，然后在10000 r/ min，4℃条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。

课程名称：植物生理学及实验实验类型：理论学习实验项目名称：植物组织中可溶性蛋白的测定1. 实验目的和要求掌握植物组织可溶性蛋白的测定的理论和技术。

2. 实验内容和原理2.1. 衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。

2.2. 衰老时的生理生化变化——蛋白质显著下降,核酸含量的变化、光合速率下降、呼吸速率下降、生物膜结构变化、植物内源激素的变化等。

2.3. 植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。

2.4. 自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA3. 主要仪器设备分光光度计、离心管、移液枪等。

4. 操作方法与实验步骤4.1. 制备蛋白提取液：称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g 离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。

4.2. 样品的测定：取40ul蛋白提取液+160ul磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。

对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。

4.3. MDA的测定：1）取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92ºC水浴保温30min2）空白管：1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液4.0ml （92ºC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min; 10000rpm3）测定A532, A450和A6004.4. 计算：1）可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg ）×提取液体积/（测定加样量×鲜重）2）MDA含量进一步求出单位鲜重植物组织中的MDA含量5. 实验数据记录和处理5.1 可溶性蛋白：老叶：3972.06(μg/g.FW)；新叶：18328.48(μg/g.FW)分析：说明在叶片衰老的过程中，可溶性蛋白的含量减少。

植物组织中可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝c—250染色法一、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue,G-250）法是利用蛋白质典料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德瓦尔镶结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。

此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由460nm变成595nm，通过测定595M 赴光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀出来。

此法灵敏度高(比Lowry法灵敏4 倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

二、实验材料、试剂与仪器设备1．实验材料植物材料。

2．试剂(1)标准蛋白质溶液(100µg/ml牛血清白蛋白) 称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至l00ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。

(2)考马斯亮蓝试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90％乙醇中，加入100ml 85％(W/A)的磷酸，再用蒸馏水定容到1000ml，贮于棕色瓶中。

常温下可保存1个月。

3．仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。

三、实验步骤1．标准曲线的绘制取6支试管，按表26-1加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。

以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2．样品测定(1)样品提取。

称取鲜样0.25g—0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min 离心10min，上清液备用。

一、实验目的和要求：（1）了解掌握可溶性蛋白测定的方法。

（2）掌握用离心机、分光光度计的基本方法和步骤。

二、实验内容和原理：内容：植物组织中可溶性蛋白的测定原理：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。

可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。

在595nm 处有最大吸收峰。

02468100.000.050.100.150.200.250.300.35Protein content ( g)A b s o r b a n c e 三、主要仪器设备和材料试剂：材料：叶龄差异明显的叶片（新叶、老叶）仪器：离心机、分光光度计器材：试管架、离心管、移液管、洗耳球、研钵、电子天平、托盘天平试剂：磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8）、考马斯亮蓝四、操作方法与实验步骤：称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心15min ，取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，冰箱保存。

剩余上清液取20-50ul 加入5ml 考马斯亮蓝，595nm 比色。

五、实验数据记录和处理：取595nm的OD值平均后可得，新叶1.125，老叶0.423上清液总体积：新叶5.0ml，老叶5.0ml将595nmOD值带入标准曲线Y=-0.00381+0.032029*X得到新叶蛋白质质量=(1.125+0.00381)/0.032029=35.24μg老叶蛋白质质量=(0.423+0.00381)/0.032029=13.32μg可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=(m*v/v’)/W新叶可溶性蛋白含量=(35.24*5/0.05)/1.00=3524.00μg/g.FW老叶可溶性蛋白含量=(13.32*5/0.05)/1.00=1332.00μg/g.FW六、实验结果与分析：实验分析：新老叶可溶性蛋白含量有明显的差异，新叶的可溶性蛋白含量明显高于老叶可溶性蛋白含量，由此可知：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。