植物可溶性蛋白的测定

实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。

在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。

由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。

该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。

[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。

(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。

(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。

(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。

B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。

使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。

(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。

H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。

之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。

冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。

待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。

使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。

因此在使用前应进行标定。

植物组织中可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G-250染色法一、原理考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内(1-1000ug)，蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。

其结合物在室温下1h内保持稳定。

此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料小麦叶片及其他植物材料（二）仪器设备722分光光度计，研钵，烧杯，两瓶，移液管，具塞刻度试管等。

（三）试剂（1）标准蛋白质溶液：100ug/mL牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。

（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入100mL 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中。

常温下课保存一个月。

三、实验步骤（一）标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂（0—100ug/mL的标准蛋白）。

混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm 光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。

以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

绘制标准曲线的各试剂加入量（二）样品测定（1）样品提取：称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000r/min离心10min，取上清液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释）于试管中。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。

常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。

方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。

其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。

再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。

这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。

LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。

LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。

但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。

因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。

且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。

大豆蛋白的可溶性检测大豆蛋白的可溶性检测1. 引言大豆蛋白作为一种重要的植物蛋白质，具有丰富的营养价值和广泛的应用领域。

在食品加工、保健品、饲料等领域中，对大豆蛋白可溶性的准确检测显得尤为重要。

本文将介绍大豆蛋白的可溶性检测方法及其应用。

2. 大豆蛋白的可溶性检测方法2.1 传统方法传统方法中，常用的检测大豆蛋白可溶性的方法是重复冻融法。

该方法通过将大豆样品在低温下冷冻后解冻，将不溶性的蛋白质与溶解性的蛋白质分离出来，进而计算可溶性蛋白质的含量。

尽管该方法简单易行，但其操作过程中存在较大的误差，且耗费时间较长。

2.2 高通量方法随着科技的进步，现代生物技术为大豆蛋白可溶性的检测提供了更多便利的方法。

酶联免疫吸附测定法（ELISA）可通过与特定抗体的结合来检测大豆蛋白的可溶性。

这种方法操作简单、快速，并能提供准确的结果。

近年来，质谱法也逐渐应用于大豆蛋白的可溶性检测中。

质谱法通过测量样品中蛋白质的质量分布，来分析蛋白质的可溶性。

这种方法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点。

3. 大豆蛋白可溶性检测的应用3.1 食品加工在食品加工中，大豆蛋白的可溶性直接关系到食品的品质和口感。

检测大豆蛋白可溶性的含量可以帮助生产商控制产品的蛋白质含量，从而保持食品的稳定性和一致性。

3.2 保健品大豆蛋白作为保健品的重要成分之一，其可溶性对保健功能起着关键作用。

通过检测大豆蛋白的可溶性含量，可以判断产品的营养价值和吸收效果，从而为消费者提供更好的健康保护。

3.3 饲料在饲料行业中，大豆蛋白的可溶性影响到动物的生长发育和饲料的营养价值。

检测大豆蛋白的可溶性含量，有助于饲料生产商调整饲料配方，以提供更加优质和均衡的饲料。

4. 我的观点和理解大豆蛋白的可溶性检测方法的不断发展为大豆蛋白的应用提供了更多可能性。

从传统的重复冻融法到现代的高通量方法，我们能够更准确、快速地检测大豆蛋白的可溶性含量。

在食品加工、保健品和饲料等领域中，这些检测方法对产品的品质、营养价值和吸收效果具有重要影响。

可溶性蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）一、实验原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。

在一定蛋白质浓度范围内蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1 h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

二、实验材料、仪器和试剂1.仪器设备分光光度计，离心机，研钵，2. 试剂(1)牛血清白蛋白配成1000 μg/mL和100 μg/mL。

(2)考马斯亮蓝G-250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL。

此溶液在常温下可放置一个月。

(3)90%乙醇(4)磷酸（85%，W/V）三、实验步骤：1.可溶性蛋白的提取称取新鲜植物样品约0.5 g置于研钵中，加入5 mL 4o C下预冷的浓度为50 mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 mL离心管中，在4 o C冰箱中静置10 min，于15000 rpm/min下冷冻离心25 min，上清液即为蛋白提取液。

4 o C下保存备用。

2.标准曲线的绘制(1)0-100 μg/mL标准曲线的制作取6支试管，按下表数据配制0-100 μg/mL血清白蛋白液各1 mL。

准确吸取所配各管溶液0.1 mL，分别放入10 mL具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2 min后，在595 nm下比色，绘制标准曲线。

配制0-100 μg/mL血清白蛋白液管号 1 2 3 4 5 6100 μg/mL牛血清蛋白量(mL)蒸馏水量(mL)蛋白质含量(mg)1.00.20.80.020.40.60.040.60.40.060.80.20.081.00.10(2)0-1000 μg/mL标准曲线的制作另取6支试管，按表10-2数据配制0-1000 μg/mL牛血清白蛋白溶液各1 mL。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。

常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。

方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。

其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。

再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。

这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。

LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。

LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。

但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。

因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。

且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约以上。