双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒说明书 微量法

3.1.1 蛋白质含量第一法紫外吸收法（见EPO）用4g/L的碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。

以4g/L的碳酸氢铵溶液作为可被，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm 和350nm的吸光度。

用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。

紫外-可见分光光度法，在波长276~280nm处，测定供试品的溶液最大吸光度A max，将A max对应波长代入回归方程，求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散色。

计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。

蛋白质含量(mg/ml)=(A max -A光散色)/ 7.43 x 供试品稀释倍数x 10。

1.仪器的校正和鉴定1)波长允许误差：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm2)吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。

3)杂散光碘化钠、亚硝酸钠2.测定法，1)对照品比较法(c x)= (A x/A R) c R，其中c x为供试品浓度；A x 为供试品溶液的吸光度c R为对照品浓度；A R为对照品溶液的吸光度。

2)吸收系数法通常吸收系数大于1003)计算分光光度法4)比色法第二法Lowry法本法用于微量蛋白质的含量測定。

蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。

试剂1〉酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10小时。

取下回流管，加入硫酸锂150g 、水50ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴，冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。

总蛋白测定试剂盒（双缩脲法）适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中总蛋白的含量。

1.1产品型号/规格及其划分说明1.2主要组成成分2.1外观2.1.1 外观（液体单试剂）.R应为蓝色透明溶液，无混浊，无未溶解物；.校准液应为浅黄色透明溶液，无混浊，无未溶解物；.试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。

2.1.2 外观（液体双试剂）a）R1应为无色溶液，无混浊，无未溶解物；b）R2应为蓝色溶液，无混浊，无未溶解物；c）校准液应为浅黄色透明溶液，无混浊，无未溶解物；d）试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。

2.2 净含量R和校准液的净含量不少于标示值。

R1、R2和校准液的净含量不少于标示值。

2.3 试剂空白吸光度在主波长540nm, 副波长700nm处（光径1cm），试剂空白吸光度A≤0.20。

2.4分析灵敏度测量1g/L的被测物时，吸光度变化△A≥0.0010。

2.5 线性区间在[10，110]g/L线性范围内，线性相关系数r≥0.990。

在[10,20]g/L范围内，绝对偏差不超过±2g/L；在(20,110]g/L范围内，相对偏差不超过±10%。

2.6 精密度2.6.1 重复性重复测定(45±5)g/L、(70±10)g/L和 (100±10)g/L的样品，变异系数CV%≤5%。

2.6.2 批间差相对极差≤5%。

2.7 准确度测定标准物质BW3627-2，测定值与靶值的相对偏差不超过±10%。

2.8 稳定性原包装的试剂盒在（2～8）℃避光保存，有效期为18个月。

试剂盒在规定的储存条件下保存至有效期满后，检测2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7项，结果应符合各项目的要求。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；1.2.掌握双缩脲试剂的配制；1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义；1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。

二、实验原理2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。

2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。

三、材料与方法：3.1.实验材料：3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。

3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。

3.2.实验步骤0.9%Nacl 0.5 - -双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0测定次数1 2 3 平均吸光度依据公式算出结果：）蛋白质标准液浓度（）血清总蛋白（g/LAAg/LSU⨯=四、结果与讨论：4.1.实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。

②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。

（如图一）图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数S 0.185 0.184 0.185 0.1847U 0.152 0.151 0.152 管号0.1517结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。

实验46.双缩脲法定量测定蛋白质一、实验目的1、学会使用移液管，掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作方法。

2、掌握分光光度计的使用，初步了解比色法的基本原理。

二、实验原理蛋白质是含氮的有机高分子化合物，分子中含有多个与双缩脲分子相似的结构（肽键），碱性硫酸铜溶液中，蛋白质与硫酸铜的Cu2+离子等络合生成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。

经比色法求出尿中蛋白质的含量。

反应如下：三、实验试剂与材料仪器试剂1.标准酪蛋白溶液（10mg/ml）酪蛋白预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据纯度称量配成标准液10.0mg/ml，用0.05N氢氧化钠溶液配制。

2. 双缩肽试剂取硫酸铜（CuSO4·5H2O.AR）1.5G和酒石酸钾钠（KNaC4H2O·4H2O.AR）6.0g分别用蒸馏水250ml溶解后，一并转入1000ml容量瓶中混合，再加入10%的NAaOH溶液300ml，随加随摇匀。

最后用蒸馏水稀释到刻度，贮存于塑料瓶中，可长期保存，如有红色或黑色沉淀出现，需重新配制。

3.未知浓度酪蛋白溶液：称取上述实验中酪蛋白0.5g，放入100ml烧杯中，加25ml0.2NNaOH 溶液，摇匀隔水加热，将溶液转移到50ml容量瓶中。

用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度，摇匀，置冰箱中保存。

仪器1.721分光光度计（使用光径为10mm的比色皿）2.刻度吸管1ml1支、2 ml2支、5ml1支3.试管（15mm×150mm）7支4.托盘天平5.分析天平6.量筒：500 ml、100 ml各1支7.容量瓶：50 ml、1000ml各1支8.恒温水浴（20-250C，如室温接近可不用）。

四、实验方法1. 标准曲线制定：取6支试管编号，按下表加入试剂上述试剂加完后，混匀，室温放置30分钟以内测完，比色（540nm ）。

记下各管光吸收度，做A 540-蛋白质浓度曲线。

总蛋白测定试剂盒（双缩脲法）
适用范围：本产品用于体外定量测定人血清中总蛋白的含量。

1.1规格
具体产品规格见下表:
1.2组成成分
硫酸铜0.12mmol/L
氢氧化钠0.75mol/L
酒石酸钾钠21.2mmol/L
2.1外观
2.1.1外包装完整无破损；
2.1.2试剂：天蓝色澄清透明液体。

2.2净含量
净含量不低于标示值。

2.3试剂空白吸光度
在主波长546nm、副波长700nm，37℃条件下，试剂空白吸光度应不大于0.2。

2.4线性
2.4.1线性范围
[10.0，100.0]g/L，相关系数r不小于0.995。

2.4.2线性偏差
[10.0，100.0]g/L线性范围内，相对偏差不超过±10%。

2.5分析灵敏度
检测浓度为70.0g/L的样本时，样本吸光度变化应不小于0.120。

2.6 重复性
测试浓度（70.0±5.0）g/L的样本，重复测试10次，CV应不大于3%。

2.7 批间差
用三个不同批号的试剂测试（70.0±5.0）g/L的同一样本，重复测试3次，相对极差R应不大于5%。

2.8 准确度
测定360012标准物质，测定结果应不超过标示值的±5%。

2.9 稳定性
原包装试剂2～8℃避光储存，有效期12个月。

效期后2个月内产品，应符合2.3、2.4、2.5、2.6和2.8的要求。

实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。

二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。

凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。

蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。

测定范围为1～10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、实验试剂和器材[试剂]1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。

棕色瓶中避光保存。

长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。

2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。

牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。

[器材]1．试管：15×150mm 试管7只；2．1ml，5ml移液管；3．坐标纸；4．721分光光度计。

四、实验操作混匀，37℃水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。

双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒说明书货号:UPLC-MS-4473规格:100T/96S微量法产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液自备-试剂一液体20mL×1瓶4℃保存-20℃保存标准品液体1mL×1支，5mg/mL溶液的配制：提取液：自备。

根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水。

产品说明：样本可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。

此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

该方法适用于蛋白质浓度高的样本，尤其是动物材料。

技术指标：最低检出限：0.1718mg/mL线性范围：0.25-12mg/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、液体样本：澄清无色液体样本可以直接测定。

2、组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心10min，取上清，即待测液。

（动物样本常常需要稀释）3、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零。

双缩脲法测定蛋白质含量一、双缩脲法实验原理双缩脲法测定蛋白质含量实验中，双缩脲是在大约180°C条件下加热两个尿素分子，以达到释放出一个氨分子而获得的产物。

在强碱性溶液中，缩二脲和硫酸铜形成紫色络合物，称为缩二脲反应。

任何包含两个酰胺基或两个直接连接的肽键或可以通过中间碳原子连接的肽键的化合物都将发生缩二脲反应。

紫色复合色的强度与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量和氨基酸组成无关。

它可以用来确定蛋白质含量。

测量范围是1-10mg蛋白质。

干扰测定的主要物质是：硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸。

这种方法的优点是速度快，不同的蛋白质产生相似的颜色，干扰物质少。

主要缺点是灵敏度差。

因此，缩二脲法通常不用于蛋白质的精确测定。

二，双缩脲法所需材料1种试剂：标准蛋白溶液的制备：用标准结晶牛血清白蛋白（bsa）或标准酪蛋白制备10mg/ml标准蛋白溶液。

可以用0.66a280校准纯度，bsa浓度为1mg/ml。

如有必要，可以使用标准蛋白质预先通过微凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，计算其纯度，然后称重，并根据其纯度制备标准蛋白质溶液。

用H2O或0.9％NaCl制备牛血清白蛋白，用0.05NaOH制备酪蛋白。

双缩脲试剂制备：称取1.50g硫酸铜（CuSO4•5H2O），6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），溶于500ml水，在搅拌下加入300ml10％NaOH溶液，用水稀释至1升，储存在塑料瓶（或内壁涂有石蜡的瓶子）。

该试剂可以长期保存。

如果在储存瓶中出现黑色沉淀物，则需要对其进行重新配制。

2台设备：可见光分光光度计，15个大试管，涡旋混合器等三，双缩脲法的实验步骤1标准曲线的确定：将12个试管分为两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml蛋白质标准溶液，用水补足1ml，再加入4ml缩二脲试剂。

摇匀后，在室温（20-25℃）下放置30分钟，并在540nm下测量颜色。

第一个不含蛋白质溶液的试管是空白对照溶液。

总蛋白测定试剂盒(双缩脲法)适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中总蛋白(TP)的含量。

1.1包装规格序号规格1 试剂1：2×50ml；校准品：1×3ml。

2 试剂1：6×60ml；校准品：1×3ml。

3 试剂1：6×100ml；校准品：1×3ml。

4 试剂1：4×100ml；校准品：1×3ml。

5 试剂1：1×1000ml；校准品：1×3ml。

6 试剂1：5×24ml；校准品：1×3ml。

7 试剂1：10L。

1.2主要组成成分本试剂由试剂1（R1）和校准品（STD）组成试剂1（R1）：氢氧化钠0.6mol/L酒石酸钾钠30mmol/L硫酸铜12mmol/L碘化钾30mmol/L校准品：蛋白质溶液（基质：水溶液；浓度：80g/L）。

2.1 外观试剂盒外观应整洁，文字符号标识清晰；R1为蓝色透明液体，校准品为无色透明液体。

液体试剂不得有沉淀和絮状物。

2.2 装量试剂瓶内液体装量应不少于标示值。

2.3 空白吸光度以生理盐水为样品，在37℃、546nm波长、1cm光径条件下，吸光度≤0.15。

2.4 分析灵敏度浓度为50g/L的样本，吸光度差值△A＞0.06。

2.5 准确性相对偏差应不大于10%。

2.6 重复性重复测试浓度在（70±10）g/L的控制血清，所得结果的重复性（变异系数，CV）应不大于10%。

2.7 线性2.7.1在(10，120)g/L范围内，线性相关系数r应不低于0.990；2.7.2 在(10，40]g/L范围内绝对偏差不超过±4.0g/L；(40，120)g/L范围内相对偏差不超过±10%。

2.8 批间差用三个批号的试剂盒测定同一份样本，试剂盒批间相对极差应不超过10%。

2.9 稳定性试剂盒在2～8℃避光保存，可稳定22个月。

取到效期后的样品检测试剂空白吸光度、分析灵敏度、准确度、重复性、线性范围应分别符合2.3、2.4、2.5、2.6、2.7的要求。