转录组解析白三叶根际溶磷菌株RW8的解磷机制

·815·水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析张宇1，2，王金开2，陈小林1*，李其利1，唐利华1，黄穂萍1，郭堂勋1，玉延华2*（1广西农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁530007；2广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004）摘要：【目的】分析白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryae ，Xoo ）侵染不同时间点的水稻转录组数据，了解其响应侵染过程中抗病相关基因的表达情况，为明确水稻对白叶枯病菌感病机制以及培育新的抗白叶枯病水稻品种提供理论参考。

【方法】以含有广谱抗性基因Xa23的水稻品系CBB23为试验材料，对其叶片接种高致病性的野生型Xoo 菌株N3-1，将接种0、48和72h 水稻样品总RNA 进行转录组测序（RNA-Seq ）。

以|log 2Fold Change|≥1，且错误发现率（False discovery rate ，FDR ）<0.01为标准筛选差异表达基因（Differentially expressed genes ，DEGs ），并进行GO 功能注释和KEGG 通路富集分析；通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）验证RNA-Seq 结果的可靠性。

【结果】RNA-Seq 转录组测序结果共获得约54.63Gb Clean data ，样品平均数据量约为6.07Gb ，Q30碱基准确率在94.34%及以上。

与对照组0h 相比，水稻CBB23在接种48和72h 两个时间点分别鉴定出2361和2117个DEGs ，其中48h 上调基因1650个、下调基因711个，72h 上调基因1440个、下调基因677个。

GO 富集结果表明，水稻的DEGs 显著富集于芳香族氨基酸的代谢及二萜类的生物合成。

KEGG 通路富集结果表明，DEGs 富集于苯丙氨酸和苯丙素类的生物合成。

elf3转录因子-回复什么是elf3转录因子？elf3转录因子是一种在植物中起重要调控作用的蛋白质。

它属于植物核因子家族，参与了许多植物生长和发育过程的调控。

elf3转录因子通过调控基因的转录水平来影响植物的形态、生长以及对环境的适应能力。

elf3转录因子的发现历程与功能研究elf3转录因子最早是通过研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）中对光周期敏感的突变体得到的。

研究人员发现，这些突变体在自然光和黑暗条件下的花期和开花时间都发生了改变。

通过进一步的实验，科学家发现这些突变体中elf3基因发生了突变，从而揭示了elf3转录因子与植物光周期调控之间的关系。

随后的研究表明，elf3转录因子在植物中具有多种功能。

首先，它参与了植物对光周期的感应和调控。

elf3转录因子可以调节其他基因的表达，从而影响植物的生物钟并调整其生长和开花时间。

其次，elf3转录因子还参与了植物对环境胁迫的应答。

例如，在极端温度下，elf3转录因子可以调节抗寒蛋白的合成，帮助植物更好地适应寒冷环境。

此外，elf3转录因子还参与了植物的光形态建成和蓝光信号转导等过程。

elf3转录因子的调控机制elf3转录因子通过直接结合到某些基因的启动子区域上，从而影响这些基因的转录水平。

这种结合可以激活或抑制目标基因的转录，从而改变基因的表达。

此外，elf3转录因子还可以通过与其他转录因子的相互作用来调节基因表达。

例如，elf3转录因子与elf4转录因子之间存在相互作用，二者共同参与拟南芥的光周期调控。

elf3转录因子的应用和潜在价值由于elf3转录因子在植物生长和发育中的重要作用，研究人员对其进行了深入研究，并尝试将其应用于农业生产中。

例如，通过基因编辑技术，科学家成功地改变了某些作物中elf3基因的表达水平，从而增强了它们对光周期的调控能力，提高了作物产量和抗逆性。

另外，elf3转录因子还被用作植物遗传工程的工具。

研究人员可以利用elf3转录因子的高特异性与其他基因的DNA结合能力，设计出可以选择性表达或静默的基因。

第52卷 第3期2024年3月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .3M a r .2024网络出版时间:2023-09-04 14:29 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.03.001网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20230831.1424.010中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析[收稿日期] 2022-12-14[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(32172792);国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(C A R S -44-K X J 7);福建农林大学硕士生导师团队项目;福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)科研扶持项目;福建省省级大学生创新创业训练计划项目(202310389027,X 202310389084) [作者简介] 郭思佳(1998-),女,四川什邡人,在读硕士,主要从事蜜蜂分子生物学研究㊂E -m a i l :g u o s i j i a 1998@163.c o m [通信作者] 付中民(1972-),男,河北唐山人,副教授,主要从事蜜蜂科学研究㊂E -m a i l :z m f @f a f u .e d u .c n郭 睿(1987-),男,安徽六安人,副教授,主要从事昆虫-病原互作研究㊂E -m a i l :r u i gu o @f a f u .e d u .c n 郭思佳1,张凯遥1,荆 欣1,高旭泽1,冯佩林1,邹培缘1,张浩宇1,陈大福1,2,郭 睿1,2,付中民1,2(1福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福建福州350002;2福建省蜂疗研究所,福建福州350002)[摘 要] ʌ目的ɔ系统鉴定和分析中华蜜蜂(A pi s c e r a n a c e r a n a )吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础㊂ʌ方法ɔ基于前期已获得的高质量中华蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过B l a s t 工具将全长转录本比对N r 数据库筛选出吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本㊂利用g f f c o m p a r e 软件将全长转录本与东方蜜蜂(A pi s c e r a n a )参考基因组上注释的转录本进行比较,鉴定未注释的新基因和新转录本㊂利用T A P I S p i p e l i n e 预测和分析吞噬与包囊作用相关基因的可变多聚腺苷酸化(a l t e r n a t i v e p o l y a d e n yl a t i o n ,A P A )位点,并通过T B t o o l s 软件鉴定A P A 位点上游的基序(m o t i f )㊂使用A s t a l a v i s t a 软件鉴定可变剪接(a l t e r n a t i v e s p l i c i n g ,A S )事件,并通过I G V 浏览器进行结构可视化㊂通过R T -P C R 验证A S 事件的真实性㊂ʌ结果ɔ共鉴定到中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关的基因66个和全长转录本395条,发掘出东方蜜蜂参考基因组未注释的2个新基因和303条新转录本㊂对参考基因组已注释的34个基因进行了结构优化,分别延伸了18个基因的5'端和12个基因的3'端,同时延长了4个基因的5'端和3'端㊂共鉴定到含有1个及以上A P A 位点的吞噬与包囊作用相关基因47个,其中多于5个A P A 位点的基因最多,为32个㊂在A P A 位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为:G R B G C N K S D A A C A A Y T R B -G C B M R N G G B Y A Y T A YW C N VWN G G ㊂共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件296次,其中包括131次可变3'端剪接(a l t e r n a t i v e 3's pl i c e s i t e ,A 3S S )㊁85次内含子保留(i n t r o n r e t e n t i o n ,I R )㊁70次可变5'端剪接(a l t e r n a t i v e 5's p l i c e s i t e ,A 5S S )和10次外显子跳跃(e x o n s k i p p i n g,E S )㊂R T -P C R 结果显示,扩增的目的片段大小符合预期,证实了随机选择的2次A S 事件的真实性㊂ʌ结论ɔ系统鉴定了中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本以及A S 事件和A P A 位点,优化了东方蜜蜂参考基因组注释的吞噬与包囊作用相关基因的结构㊂[关键词] 中华蜜蜂;吞噬作用;包囊作用;全长转录本;纳米孔测序;可变剪接;可变多聚腺苷酸化[中图分类号] S 895.137[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)03-0001-10I d e n t i f i c a t i o n a n d a n a l y s i s o f f u l l -l e n g t h t r a n s c r i p t s o f ge n e s r e l a t i v e t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a G U O S i j i a 1,Z H A N G K a i y a o 1,J I N G X i n 1,G A O X u z e 1,F E N G P e i l i n 1,Z O U P e i yu a n 1,Z H A N G H a o y u 1,C H E N D a f u 1,2,G U O R u i 1,2,F U Z h o n gm i n 1,2(1C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e s (C o l l e g e o f B e e S c i e n c e ),F u j i a n A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,F u z h o u ,F u ji a n 350002,C h i n a ;2A p i t h e r a p y R e s e a r c h I n s t i t u t e o f F u j i a n P r o v i n c e ,F u z h o u ,F u ji a n 350002,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔS y s t e m a t i c i d e n t i f i c a t i o n a n d i n v e s t i g a t i o n o f g e n e s a n d f u l l -l e n g t h t r a n s c r i pt sa s s o c i a t e d w i t h p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A p i s c e r a n a c e r a n a w e r e c o n d u c t e d,a i m i n g t o p r o v i d eb a-s i s f o r f u r t h e r f u nc t i o n a l s t ud y o n re l a t e d g e n e s a n d i s of o r m s.ʌM e t h o dɔB a s e d o n p r e v i o u s l yg a i n e dhi g h-q u a l i t y N a n o p o r e l o n g r e a d s e q u e n c i n g d a t a f r o m A p i s c e r a n a c e r a n a,t h e m a p p i n g o f f u l l-l e n g t h t r a n-s c r i p t s t o N r d a t a b a s e w a s c o n d u c t e d b y B l a s t t o o l t o i d e n t i f y f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s r e l a t i v e t o p h a g o c y t o-s i s a n d c a p s u l a t i o n.T h e f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e a n n o t a t e d o n r e f e r e n c e g e n o m e u s i n g t h e g f f c o m p a r e s o f t w a r e t o i d e n t i f y u n a n n o t a t e d n o v e l g e n e s a n d f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s.P r e d i c t i o n a n d a n a l y s i s o f a l t e r n a t i v e p o l y a d e n y l a t i o n(A P A)s i t e s w e r e c o n d u c t e d w i t h T A P I S p i p e l i n e,f o l l o w e d b y i d e n t i f i c a t i o n o f m o t i f s u p s t r e a m o f A P A s i t e s b y T B t o o l s s o f t w a r e.A s t a l a v i s t a s o f t w a r e w a s e m p l o y e d t o i d e n t i f y a l t e r n a t i v e s p l i c i n g(A S)e v e n t s f o l l o w e d b y s t r u c t u r a l v i s u a l i z a t i o n b y I G V b r o w s e r.R T-P C R w a s p e r f o r m e d t o v a l i d a t e t h e a u t h e n t i c i t y o f A S e v e n t s.ʌR e s u l tɔA t o t a l o f66g e n e s a n d395f u l l-l e n g t h t r a n-s c r i p t s r e l e v a n t t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A p i s c e r a n a c e r a n a w e r e d i s c o v e r e d,i n c l u d i n g2n e w g e n e s a n d303n e w t r a n s c r i p t s u n a n n o t a t e d o n t h e r e f e r e n c e g e n o m e o f A p i s c e r a n a.T h e s t r u c t u r e o f34 a n n o t a t e d g e n e s o f t h e r e f e r e n c e g e n o m e w a s o p t i m i z e d,a m o n g w h i c h5'e n d s o f18g e n e s a n d3'e n d s o f12 g e n e s w e r e e x t e n d e d,a n d5'e n d s a n d3'e n d s o f4g e n e s w e r e p r o l o n g e d.A d d i t i o n a l l y,47g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n w e r e i d e n t i f i e d t o c o n t a i n o n e o r m o r e A P A s i t e s.T h e n u m b e r o f g e n e s w i t h m o r e t h a n5A P A s i t e s w a s32.M u l t i p l e m o t i f s w e r e i d e n t i f i e d i n u p s t r e a m o f A P A s i t e s,a n d t h e c o n s i s t-e n t s e q u e n c e w a s G R B G C N K S D A A C A A Y T R B G C B MR N G G B Y A Y T A YW C N VWN G G.I n t o t a l,296A S e v e n t s w e r e i d e n t i f i e d,i n c l u d i n g131a l t e r n a t i v e s3's p l i c e s i t e s(A3S S),85i n t r o n r e t e n t i o n(I R),70a l t e r-n a t i v e5's p l i c e s i t e s(A5S S)a n d10e x o n s k i p p i n g(E S).R T-P C R s h o w e d t h a t t h e s i z e s o f a m p l i f i e d f r a g-m e n t s w e r e c o n s i s t e n t w i t h e x p e c t e d s i z e s,c o n f i r m i n g t h a t t h e a u t h e n t i c i t y o f t h e2r a n d o m l y s e l e c t e d A S e v e n t s.ʌC o n c l u s i o nɔG e n e s a n d f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s r e l a t i v e t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A p i s c e r-a n a c e r a n a a n d A S e v e n t s a s w e l l a s A P A s i t e s w e r e s y s t e m a t i c a l l y i d e n t i f i e d,a n d s t r u c t u r e s o f p h a g o c y t o-s i s a n d c a p s u l a t i o n-a s s o c i a t e d g e n e s w e r e o p t i m i z e d.K e y w o r d s:A p i s c e r a n a c e r a n a;p h a g o c y t o s i s;c a p s u l a t i o n;f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s;N a n o p o r e s e q u e n-c i n g;a l t e r n a t i v e s p l i c i n g;a l t e r n a t i v e p o l y a d e n y l a t i o n蜜蜂是自然界最重要的授粉昆虫,在生态平衡和粮食安全方面发挥举足轻重的作用㊂中华蜜蜂(A p i s c e r a n a c e r a n a),简称中蜂,是东方蜜蜂(A p i s c e r a n a)的指名亚种,也是我国养蜂生产中使用的主要蜂种之一,经过长期的适应性进化已高度适应我国地理环境,具有重要的生态和经济价值[1]㊂近年来,以牛津纳米孔(N a n o p o r e)长读段测序技术为代表的第三代测序技术不断革新㊁突飞猛进,在组装染色体级别基因组和揭示转录组复杂性等方面应用广泛㊂由于具有超长读长的显著优势,牛津纳米孔测序技术已成功应用于可变剪接体(i s o-f o r m)㊁可变剪切(a l t e r n a t i v e s p l i c i n g,A S)和可变多聚腺苷酸化(a l t e r n a t i v e p o l y a d e n y l a t i o n,A P A)位点等的精确鉴定和分析[2-3]㊂目前,基于牛津纳米孔测序技术的全长转录组研究已见诸于橄榄果蝇(B a c t r o c e r a o l e a e)[4]㊁亚洲飞蝗(L o c u s t a m i g r a t o-r i a)[5]和椰蛀犀金龟(O r y c t e s r h i n o c e r o s)[6]等昆虫中㊂东方蜜蜂的全长转录组研究报道迄今仅有2例,L i u等[7]对长白山东方蜜蜂越冬期抗寒性的全长转录本进行了分析,确定了5941个完整的O R F 序列;蔡宗兵等[8]在中华蜜蜂中肠中鉴定到265个与细胞色素P450相关的全长转录本㊂此前,本课题组利用牛津纳米孔测序技术对蜜蜂的2种真菌病原蜜蜂球囊菌(A s c o s p h a e r a a p i s)和东方蜜蜂微孢子虫(N o s e m a c e r a n a e)进行了较为系统的全长转录组研究[9-14],但中蜂的全长转录组研究总体上仍较为滞后㊂作为无脊椎动物,蜜蜂等昆虫缺乏获得性免疫,但拥有包括细胞免疫和体液免疫在内的天然免疫系统㊂当侵入昆虫血淋巴的病原体被宿主细胞识别后,宿主的细胞免疫随即被激活,进而合成与分泌抗菌肽,抵御病原侵染[15]㊂吞噬和包囊作用是昆虫的2种重要细胞免疫反应,吞噬能直接杀死真菌孢子和外源小分子,而包囊能抵御如寄生虫等无法被吞噬的入侵者[16]㊂W a n g等[17]研究发现,棉铃虫(H e l i c o v e r p a a r m i g e r a)20E-H a E c R-H a U S P复合物刺激血淋巴中H a C T L1基因的表达,进而提高2西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷H a C T L1蛋白的合成与分泌,并促进细胞吞噬和包囊作用,抵抗中华卵索线虫(O v o m e r m i s s i n e n s i s)的侵袭㊂在果蝇(D r o s o p h i l a)中,TM9S F4基因突变可引起吞噬与包囊作用缺失,导致果蝇对革兰氏阴性菌更加敏感[18]㊂P a r k等[19]利用二代测序技术组装和注释了东方蜜蜂的参考基因组,但由于二代测序产生的读段较短,故该版本参考基因组仅组装到重叠群(c o n t i g)水平,东方蜜蜂参考基因组仍需要进一步完善㊂目前,人们对中蜂吞噬与包囊作用的认识非常有限,对其相关基因和全长转录组缺乏深入的研究㊂前期研究中,本课题组已利用牛津纳米孔测序技术对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道组织进行了测序,获得了高质量的长读段数据[8]㊂在此基础上,本研究对中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本进行了系统鉴定,对东方蜜蜂参考基因组已注释的吞噬与包囊作用相关基因进行结构优化,进而发掘和分析吞噬与包囊作用相关基因的A P A位点和A S事件,并对A S事件进行分子验证,以期丰富中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本的相关信息,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础㊂1材料与方法1.1细胞吞噬与包囊作用相关基因与全长转录本的筛选与分析本课题组前期已完成中蜂幼虫4,5和6日龄肠道样品(A c4组㊁A c5组和A c6组)制备㊁R N A提取㊁c D N A建库及牛津纳米孔测序㊂A c4㊁A c5和A c6组测序结果分别获得了7338627,7003419和7434233条原始读段,其N50分别为1276,1306和1404b p,平均读长分别为1126,1126和1166 b p,最大长度分别为16628,12808和14359b p,质量值均达到Q12[8]㊂高质量的长读段测序数据可用于本研究中中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本的鉴定及分析㊂使用B l a s t工具(参数为默认设置)将鉴定到的所有全长转录本序列比对到G O(h t t p://g e n e o n t o l o g y.o r g/)㊁K E G G(h t t p s:// w w w.k e g g.j p/)和N r(h t t p s://f t p.n c b i.n l m.n i h.g o v/b l a s t/d b/F A S T A/)数据库,再根据注释信息筛选细胞吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本㊂1.2东方蜜蜂参考基因组中已注释细胞吞噬与包囊作用相关基因的结构优化按照本课题组已建立的技术流程[12,20],利用g f f c o m p a r e软件(参数为默认设置)将本研究中鉴定到的细胞吞噬与包囊作用相关全长转录本与中蜂参考基因组(A C S N U-2.0)上已注释的转录本进行比较,以发现未注释的新基因和转录本,并对已注释基因进行结构优化㊂如果在原有基因边界之外的区域有比对读段(m a p p e d r e a d s)支持,则将基因的非翻译区向上㊁下游延伸,以修正基因的边界㊂1.3细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A位点鉴定与分析参照杜宇等[11]报道的方法,利用T A P I S p i p e-l i n e[21]鉴定细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A 位点,参数设置为:-n o r c㊁-m e m e-m i n w6㊁-m e m e-m a x w6㊁-s p a m o-s k i p㊁-f i m o-s k i p㊂通过T B t o o l s软件[22]对细胞吞噬与包囊作用相关基因A P A位点上游50b p的序列特征进行分析,以鉴定基序(m o-t i f)㊂1.4细胞吞噬与包囊作用相关基因的可变剪接分析参照陈华枝等[13]和杜宇等[11]报道的方法,使用A s t a l a v i s t a软件[23]鉴定中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S事件类型,其中包括互斥外显子(m u t u a l l y e x c l u s i v e e x o n,M E E)㊁内含子保留(i n-t r o n r e t e n t i o n,I R)㊁外显子跳跃(e x o n s k i p p i n g, E S)㊁可变3'端剪接(a l t e r n a t i v e3's p l i c e s i t e,A3S S)和可变5'端剪接(a l t e r n a t i v e5's p l i c e s i t e,A5S S)㊂参数为默认设置㊂根据预测结果统计以上可变剪接类型数量㊂1.5细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S事件验证中蜂幼虫取自福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)蜜蜂保护课题组的实验蜂群㊂参照本课题组已建立的技术流程[24-26],从蜂群中提取巢脾,在实验室中将2日龄幼虫移至干净的48孔培养板,放入恒温恒湿箱,在温度为35ħ㊁相对湿度(R H)为90%的条件下饲养,分别剖取4,5和6日龄幼虫肠道组织,液氮速冻后迅速转移到-80ħ超低温冰箱保存,备用㊂为验证细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S事件准确性,以β-a c t i n为内参基因,随机选择2种A S 类型(A3S S㊁I R)的1个基因进行R T-P C R验证㊂根据上述基因的核酸序列设计跨剪接位点的特异性引物,交由生工生物(上海)公司合成(表1)㊂以肌动蛋白基因β-a c t i n(L O C107999330)作为内参基因,将上述制备的4,5和6日龄幼虫肠道的R N A等物3第3期郭思佳,等:中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析质的量混合后进行反转录,获得c D N A ㊂以得到的c D N A 作为模板进行P C R 扩增,反应体系和程序参照蔡宗兵等[8]的报道进行㊂P C R 产物经3%琼脂糖凝胶电泳后使用核酸凝胶成像仪进行检测和拍照㊂表1 本研究中使用的引物序列T a b l e 1 S e q u e n c e s o f p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d yA S 类型T y pe of A S 基因或基因I DG e n e o r g e n e I D预测的转录本号P r e d i c t e d t r a n s c r i pt n u m b e r 序列S e qu e n c e I RL O C 107999286O N T.6127.13(444b p ),O N T.6127.3(341b p)F :5'-C T C A C G G A A C T A C C A C G G -3'R :5'-G G G A T A T T C G C C A C A A C A -3'A 3S S L O C 107999764O N T.6364.6(362b p ),O N T.6364.2(425b p)F :5'-A G A A A G A G C A T T A G G A G A -3'R :5'-G G A G T A C G T T G A A T A G G A -3'-β-a c t i n -F :5'-T T A T A TG C C A A C A C T G T C C T T T -3'R :5'-A G A A T T G A T C C A C C A A T C C A -3'注:括号中的数据为片段长度㊂N o t e :D a t a i n t h e b r a c k e t s i s t h e l e n g t h o f t r a n s c r i pt .2 结果与分析2.1 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本的鉴定与分析试验共鉴定到吞噬相关的基因65个和全长转录本391条,包囊作用相关的基因1个和全长转录本4条,其中包括东方蜜蜂参考基因组上未注释的2个新基因和303条新转录本㊂对鉴定到的基因进行K E G G 和G O 注释,结果有62个基因注释到22条K E G G 通路(图1);有65个基因注释到53个G O 条目,其中P 值排序前20的条目见图2㊂图中数据为注释到的基因数及其占比㊂图2同D i g i t s i n d i c a t e n u m b e r s o f g e n e s a n n o t a t e d a n d i t s r a t i o .F i g.2i s t h e s a m e 图1 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的K E G G 注释F i g .1 K EG G a n n o t a t i o n s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 4西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷图2 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的G O 注释F i g .2G O a n n o t a t i o n s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l e i n A pi s c e r a n a c e r a n a 2.2 东方蜜蜂参考基因组已注释细胞吞噬与包囊作用相关基因的结构优化试验共对东方蜜蜂参考基因组上已注释的34个细胞吞噬与包囊作用相关基因的结构进行了优化,其中正链结构优化的基因为17个,负链结构优化的基因为17个;5'端延长的基因有18个,延长长度介于4~5512b p;3'端延长的基因有12个,延长长度介于1~3218b p;3'和5'端均延长的基因有4个,分别为L O C 107999172,L O C 107999330,L O C 108000752和L O C 108003556(表2)㊂表2 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因结构优化的详细信息T a b l e 2 D e t a i l e d i n f o r m a t i o n o f s t r u c t u r a l o p t i m i z a t i o n o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 基因I DG e n e I D参考序列R e f e r e n c e s e qu e n c e 优化前的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s b e f o r e o pt i m i z a t i o n 优化后的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s a f t e r o pt i m i z a t i o n 正负链P o s i t i v e o r n e ga t i v e s t r a n d 末端E n d L O C 107998143NW _016019219.11777187-17784171771675-1778417+5'L O C 108003298NW _016019863.197472-9977891999-99778-5'L O C 107995660NW _016017456.11776644-18069261774455-1806926+5'L O C 107999172NW _016019319.1419590-429628417412-429628+5'L O C 107997445NW _016019153.11089494-11037821087610-1103782-5'L O C 107999159NW _016019319.117703-2478016575-24780-5'L O C 107994640NW _016018544.15265-71014277-7101-5'L O C 107999790NW _016019364.180049-8323779245-83237-5'L O C 107994136NW _016018344.11816913-18226661816182-1822666-5'L O C 107999764NW _016019364.1946296-958611945624-958611-5'L O C 108000406NW _016019441.1709872-713105709245-713105-5'L O C 107997632NW _016019175.11062418-10727961061901-1072796-5'L O C 108000577NW _016019442.1960650-965211960161-965211-5'5第3期郭思佳,等:中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析表2(续) T a b l e 2(c o n t i n u e d)基因I DG e n e I D参考序列R e f e r e n c e s e qu e n c e 优化前的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s b e f o r e o pt i m i z a t i o n 优化后的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s a f t e r o pt i m i z a t i o n 正负链P o s i t i v e o r n e ga t i v e s t r a n d 末端E n d L O C 107999330NW _016019330.11372267-13770341371781-1377034-5'L O C 108000587NW _016019442.1569024-569997568540-569997-5'L O C 108000752NW _016017512.1181972-183084181594-183084-5'L O C 107998213NW _016019219.12093759-21004742093552-2100474-5'L O C 107998677NW _016019275.1760522-765147760336-765147-5'L O C 107999232NW _016019330.1492630-495090492481-495090-5'L O C 108001305NW _016019552.1187553-189571187438-189571-5'L O C 107995080NW _016017456.1516106-518939516101-518939+5'L O C 108003556NW _016017567.12875991-28786182875987-2878618+5'L O C 107999330NW _016019330.11371781-13770331371781-1377034-3'L O C 107992565NW _016017856.1183783-185914183783-185924+3'L O C 108001195NW _016017512.1514991-517027514991-517058+3'L O C 108000752NW _016017512.1181594-182906181594-183084-3'L O C 107998372NW _016019231.11386200-13883801386200-1388790+3'L O C 107995099NW _016018567.1136406-140802136406-141304+3'L O C 107993924NW _016018256.1253448-258337253448-258848+3'L O C 107997332NW _016017457.1590209-593951590209-594488+3'L O C 108003264NW _016017556.1192600-196182192600-196785+3'L O C 107992702NW _016017899.1 211-1820211-2563+3'L O C 107999172NW _016019319.1417412-428815417412-429628+3'L O C 108000484NW _016019441.14376457-43802124376457-4381188+3'L O C 108003556NW _016017567.12875987-28772962875987-2878618+3'L O C 108002524NW _016017455.1845010-847931845010-849556+3'L O C 122719477NW _016017767.1310646-314815310646-318033+3'L O C 107995086NW _016018567.1848331-849310848331-849899+3'2.3 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A位点鉴定与分析试验共鉴定到含有1个及以上A P A 位点的细胞吞噬与包囊作用相关基因47个(图3),其中多于5个A P A 位点的基因最多,为32个;含有1个A P A 位点的基因次之,为6个;含有2个和3个A P A 位点的基因均为4个;含有4个A P A 位点的基因为1个㊂此外,在细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A 位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为:G R B G C N K S D A A C A A Y T R B G C B M R N G G B Y -A Y T A YW C N VWN G G (图4)㊂图3 不同数量A P A 位点中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的分布F i g.3 D i s t r i b u t i o n o f d i f f e r e n t n u m b e r s o f A P A s i t e s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l e i n A pi s c e r a n a c e r a na 图4 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的一致性基序F i g .4 M o t i f s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 6西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷2.4 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件鉴定与分析试验共鉴定到细胞吞噬与包囊作用相关基因的296次A S 事件,其中数量最多的类型是可变3'端剪接(A 3S S ,131次),其次为内含子保留(I R ,85次)和可变5'端剪接(A 5S S ,70次),数量最少的类型为外显子跳跃(E S ,10次)(图5)㊂部分细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件详细信息见表3㊂表3 细胞吞噬与包囊作用相关基因的可变剪接事件(A S)详细信息(仅展示6个)T a b l e 3 D e t a i l i n f o r m a t i o n o f a l t e r n a t i v e s p l i c i n g e v e n t s o c c u r r e d i n p h a g o c yt o s i s a n d c a p s u l a t i o n r e l e v a n t g e n e s (s i x d i s p l a y e d o n l y)基因I DG e n e I D转录本I DT r a n s c r i pt I D A S 事件类型A S e v e n t t y pe 参考序列R e f e r e n c e s e q u e n c e 链属S t r a n d t y pe 区域R e gi o n L O C 107999286O N T.6127.13,O N T.6127.3I RNW _016019330.1C 3148146-3148035L O C 107999764O N T.6364.6,O N T.6364.2A 3S S NW _016019364.1C 949340-949306L O C 107999286O N T.6127.7,O N T.6127.2E SNW _016019330.1C3172740-3172667L O C 107995660O N T.309.1,O N T.309.2A 5S S NW _016017456.1W 1780668-1780704L O C 107995099O N T.3315.1,O N T.3315.3A 3S S NW _016018567.1W 137912-137926L O C 107992565O N T.1750.1,O N T.1750.2I R NW _016017856.1W183906-184992注:C 和W 分别代表负义链和正义链㊂N o t e :C a n d W r e p r e s e n t n o n s e n s e s t r a n d a n d s e n s e s t r a n d ,r e s p e c t i v e l y.图5 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件类型F i g .5 T y p e s o f A S e v e n t s i n g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c yt o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 2.5 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件验证随机选择2种A S 事件类型进行R T -P C R 验证,结果(图6)显示,L O C 107999764基因可检测到2条转录本,大小分别约为425和362b p ,与基于测序数据预测出的O N T.6364.2和O N T 6364.6的大小(表1)一致;L O C 107999286基因可检测到2条转录本,大小分别约为444和341b p,与基于测序数据预测出的O N T.6127.3和O N T.6127.13的大小(表1)一致㊂上述结果表明,本研究鉴定到的A S 事件真实可靠㊂A ,C .A 3S S 和I R 的可变剪接事件类型示意图,方框表示外显子,直线表示内含子,箭头表示转录方向;B ,D.L O C 107999764和L O C 107999286扩增产物的琼脂糖凝胶电泳A a n d C s h o w t y p e s o f a l t e r n a t i v e s p l i c i n g e v e n t s o c c u r r e d i n A 3S S a n d I R ,r e c t a n g l e s r e p r e s e n t e x o n s ,a n d b l a c k l i n e s r e pr e s e n t i n t r o n s ,a r r o w i n d i c a t e d i r e c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n ;B a n d D s h o w a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s f o r a m pl i f i e d pr o d u c t s f r o m L O C 107999764a n d L O C 107999286图6 中蜂2个基因可变剪接事件的P C R 验证F i g .6 P C R v a l i d a t i o n o f a l t e r n a t i v e s p l i c i n g e v e n t s o c c u r r e d i n t w o g e n e s i n A pi s c e r a n a c e r a n a 7第3期郭思佳,等:中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析3讨论此前,P a r k等[19]利用二代测序技术组装和注释了东方蜜蜂的参考基因组(A C S N U-2.0),该版本的基因组大小约为238M b,共包含10651个编码基因,其中注释到吞噬作用的基因和转录本数目分别为95个和182条,注释到包囊作用的基因和转录本数目分别为1个和1条㊂基于已获得的高质量牛津纳米孔测序数据,本研究共鉴定到中蜂吞噬作用相关的基因65个和全长转录本391条,包囊作用相关的基因1个和全长转录本4条,其中包括参考基因组上未注释的新基因2个和新转录本303条㊂这为持续深入开展中蜂吞噬与包囊作用相关基因和i s o-f o r m的研究提供了宝贵的材料㊂U T R主要通过顺式调节元件和R N A结合蛋白(或小R N A反式作用因子)之间的动态相互作用来调节特定的m R N A的代谢和翻译[27]㊂3'U T R 参与m i R N A或以蛋白质为基础的m R N A的降解机制,而5'U T R影响m R N A的翻译效率[28]㊂本研究共对东方蜜蜂参考基因组上已注释的34个吞噬与包囊作用相关基因结构进行优化,延长了18个基因的5'U T R(延长长度介于4~5512b p)和12个基因的3'U T R(延长长度介于1~3218b p),同时延长了4个基因的5'U T R和3'U T R㊂这为进一步开展上述中蜂吞噬与包囊作用相关基因表达调控的深入研究提供了重要基础㊂A P A通过产生编码序列或3'U T R不同的异构体,从而调节目标R N A的功能㊁稳定性㊁定位和翻译效率,促进转录组的复杂性[29]㊂哺乳动物基因组中有50%~80%的基因发生A S和A P A,进而产生数量众多的剪接异构体[30];在人(H o m o s a p i e n s)中,至少有70%的基因含有A P A位点[31-32];在小鼠(M u s m u s c u l u s)中,32%的表达基因经历A P A[33];在水稻(O r y z a s a t i v a)中,约48%的基因含有A P A 位点[34];在小麦(T r i t i c u m a e s t i v u m)中,有31%的基因含有A P A位点[35];在拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)中,超过60%的基因含有A P A位点[36]㊂本研究鉴定到中蜂吞噬与包囊作用相关的66个基因,其中有47(约71.2%)个基因含有1个及以上的A P A位点,表明中蜂吞噬与包囊作用相关的基因多数发生A P A㊂其中,多于5个A P A位点的基因最多,这与他人对热带爪蟾(X e n o p u s t r o p i c a l i s)[37]和蜜蜂球囊菌[11]等物种的研究报道一致㊂但在高粱[38]和草地贪夜蛾(S p o d o p t e r a f r u g i p e r d a)[39]等物种中,含2个A P A位点的基因最为丰富㊂上述结果表明,不同物种中,A P A位点数的分布规律存在差异㊂此外,在吞噬与包囊作用相关基因的A P A 位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为:G RB G C-N K S D A AC A A Y T R B G C B M R N G G B Y A Y T A YW-C N VWN G G㊂人类基因的A P A位点上游存在1个经典m o t i f(A A U A A A),该基序同样存在于果蝇基因A P A位点上游[40]㊂M a等[35]在小麦基因的A P A位点上游鉴定到多个基序,其中出现频率最高的是A A U A A A㊁A U A U A U和U A U A U A㊂玉米(Z e a m a y s)基因的A P A位点上游出现频率前3位的基序为:A A U A A A㊁A U A U A U和U A U A U A[41]㊂本课题组在东方蜜蜂微孢子虫基因的A P A位点上游发现3个基序:A A U A A A㊁U G A U G C和G C G A C G[13],在蜜蜂球囊菌基因的A P A位点上游鉴定到4个基序:A U G A U A A㊁C A U G A A C㊁G U U C A A U和U C A U C A U[42]㊂以上结果表明,A P A上游基序具有一定的种属特异性㊂W a n g等[30]研究发现,哺乳动物基因进化过程中聚腺苷酸化位点(p o l y a d e n y l a t i o n s i t e s,P A S)选择对A P A施加进化压力的基因特征包括基因年龄㊁基因表达模式和基因功能㊂本研究鉴定到的基序与其他物种中A P A位点上游的基序均不相同,推测可能是由于高分化细胞一般倾向于使用远端P A S,导致具有较长3'U T R的转录本表达,而生长较快的细胞则倾向于使用近端P A S,产生较短的3'U T R,从而导致产生的转录本具有潜在的高表达水平[43]㊂A S 在基因的功能多样性中扮演着重要的角色,由A S 产生的蛋白质异构体在酶活性㊁定位或稳定性等方面存在差异,从而影响细胞的活动[44]㊂本研究共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的296次A S事件,说明中蜂吞噬与包囊作用相关基因广泛发生A S㊂其中,最丰富的A S事件类型是A3S S(131次),其次是I R(85次),数量最少的为E S(10次)㊂在硝酸盐胁迫条件下,大豆(G l y c i n e m a x L.)根系中R I 和A3S S是最常见的A S类型,其中A3S S产生的剪接异构体的相对表达量在不同硝酸盐条件差异显著[45]㊂L e v e s q u e等[46]报告了第一个关于癌症中A3S S使用的全基因组研究,强调了乳腺癌中数百个不同剪接的事件,表明A3S S在乳腺癌整体剪接网络中具有重要作用㊂I R和A3S S主要涉及调节前体m R N A产生不同的成熟剪接体,调节细胞中基因的表达,然后影响编码蛋白的功能[47]㊂本研究通过R T-P C R对随机选择2种A S事件类型进行验8西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷证,结果显示L O C107999764和L O C107999286均能扩增出2条转录本,大小与基于测序数据的预测结果一致,表明中蜂吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件真实可靠㊂[参考文献][1]曾志将.养蜂学[M].北京:中国农业出版社,2017.Z e n g Z J.A p i c u l t u r e[M].B e i j i n g:C h i n a A g r i c u l t u r e P r e s s, 2017.[2] D e a m e r D,A k e s o n M,B r a n t o n D.T h r e e d e c a d e s o f n a n o p o r es e q u e n c i n g[J].N a t u r e B i o t e c h n o l o g y,2016,34(5):518-524.[3] W a n g Y,Z h a o Y,B o l l a s A,e t a l.N a n o p o r e s e q u e n c i n g t e c h n o-l o g 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活性氧(reactive oxygen species,ROS)在植物生长发育和胁迫响应中扮演着十分重要的角色,研究其产生和清除机制有着十分重要的意义。

ROS 主要包括超氧阴离子(O 2-·)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H 2O 2)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(1O 2)等[1]。

其中,H 2O 2是最稳定的存在形式,也是植物体内重要的信号分子,因此维持体内H 2O 2稳态具有十分重要的意义[2]。

过氧化氢酶(catalase,CAT)是发现最早也是目前研究最透彻的H 2O 2清除酶之一,其功能和相关调控机制仍是当下植物研究DOI:10.16605/ki.1007-7847.2023.01.0110过氧化氢酶在植物生长发育和胁迫响应中的功能研究进展刘聪,邓宇宏,刘选明*,林建中*(湖南大学生物学院植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室国家耐盐碱水稻技术创新中心,中国湖南长沙410082)收稿日期:2023-01-01;修回日期:2023-03-07;网络首发日期:2023-04-10基金项目:国家自然科学基金资助项目(31871595);湖南省自然科学基金资助项目(2020JJ4004);国家耐盐碱水稻技术创新中心项目(2022PT1005);杂交水稻国家重点实验室(湖南杂交水稻研究中心)开放课题(2019KF02);海南省崖州湾种子实验室揭榜挂帅项目(B21HJ0108)作者简介:刘聪(1991—),男,河南郑州人,博士;刘聪和邓宏宇对本文的贡献相同,为本文共同第一作者;*通信作者:林建中(1975—),男,湖南会同人,博士,湖南大学副教授,主要从事植物生理与分子生物学研究,Tel:*************,E-mail:*****************.cn;刘选明(1963—),男,湖南邵阳人,博士,湖南大学教授,主要从事植物功能基因组学研究,Tel:*************,E-mail:*************.cn 。

溶磷菌的解磷促生效应及其在未来农业中的应用前景作者：陆瑞霞曾庆飞王小利来源：《现代园艺·下半月园林版》 2014年第8期陆瑞霞曾庆飞王小利（贵州省草业研究所，贵州贵阳550006）摘要：溶磷菌是农业生态系统中的一类重要土壤微生物，能将无效态的磷元素转变成可被植物直接吸收利用的可溶性磷，作为环境友好的生物因子，在“白色农业”、绿色农业的发展过程中发挥着重要作用。

本文综述了溶磷菌的溶磷特性、溶磷机理及已发现的溶磷菌种类，并对植物根际溶磷菌的溶磷促生效应及其在现代农业中的应用前景作了简略分析。

关键词：溶磷菌；促生效应；未来农业；应用前景磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，当植株体内缺磷时，蛋白质、核酸、辅酶等重要生物分子的合成都会受到影响，进而导致植物分枝减少，植株矮小。

在农田土壤中，磷是以磷酸盐的化合状态存在的，不同土壤类型中其化合形式也有所不同。

我国南方土壤中主要存在着蓝铁矿（Fe3(PO4)2·2H2O）、粉红磷铁矿（FePO4·2H2O）及闭蓄态磷酸盐等；在北方的石灰性土壤中，磷酸二钙、磷酸八钙、磷酸十钙（氟磷灰石，羟基磷灰石）等钙镁磷酸盐是主要的存在形式。

各地土壤中都含有一定比例的铝磷酸盐。

化合态中的磷由于与土壤中的Fe3+、Ca2+和Al3+等结合而呈水不溶性，很难被植物吸收，所以农业生产中每年必须向土壤施入大量的可溶性磷肥。

不过，作物对当季所施磷肥的利用率一般只有5%～10%，加上作物的后效，也不超过25%，施入土壤的大部分磷肥实际上是以无效态累积于土壤中的。

因此，为了挖掘土壤中潜在的磷库资源，降低化肥过量施用所造成的环境污染，寻找开发具有溶磷能力的土壤微生物便成了发展绿色农业的重要任务之一。

1 溶磷菌及其优势存在区域溶磷菌是对存在于植物根际和自然土壤中能使难溶性或不溶性的磷转化为易于被植物吸收利用的可溶性磷的微生物的总称，它们是农业生态系统中一类重要的土壤微生物。

三白草提取物对自由基的清除作用研究刘晓欣;曹光群;刘学【摘要】The scavenging effects of four fractions of the extract from Saururus on DPPH free radical,hy-droxyl free radical(·OH)and superoxide free radical(O2 - ·)were studied. BHT was used as refer-ence. The results showed that all fractions possessed DPPH free radical,hydroxyl free radical(·OH)and superoxide free radical(O2- ·)scavenging effects. The ethyl acetate fraction possessed the strongest scav-enging activity on DPPH free radical,hydroxyl free radical(·OH)and superoxide free radical(O2- ·).%考察了三白草乙醇提取物经不同溶剂萃取所得的各部分对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基和超氧自由基的清除能力。

以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）为参考。

结果表明，三白草乙醇提取物经不同溶剂萃取所得的各部分对 DPPH 自由基、羟基自由基和超氧自由基都具有清除能力，且随着提取物浓度的增加，清除能力逐渐增高；其中乙酸乙酯部分对 DPPH 自由基、羟基自由基和超氧自由基的清除作用最强。

【期刊名称】《应用化工》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】3页(P877-879)【关键词】三白草;羟基自由基;超氧自由基;DPPH 自由基【作者】刘晓欣;曹光群;刘学【作者单位】江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡 214122;江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡 214122;江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】TQ28;R284.2自从Dan Harman提出衰老的自由基学说和Me.Cord首先发现SOD并成功提取以来，研究人员开始关注自由基清除剂类皮肤抗衰老化妆品的研制和应用。