外周血PBMC的分离

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。

其中淋巴细胞占很大一部分。

分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。

红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。

吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。

否则将分层混乱。

步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。

然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。

离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。

此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。

e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。

其中淋巴细胞占很大一部分。

分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。

红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。

吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。

否则将分层混乱。

步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。

然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。

离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。

此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。

e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。

外周血中PBMC分离
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

实验步骤：
1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）
2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）
3.18℃，1500r/min，离心30min
4.轻轻吸取PBMC层移入另一试管中
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心5min ，弃上清。

分离全血中的PBMC注意事项：
1 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞
2 Ficoll应适量，外周血应充分稀释，温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果
3 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面
4 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。

人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。

PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。

为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。

一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。

2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。

3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。

二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。

2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。

3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。

三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。

2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。

3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。

对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。

PBMC的分离物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。

2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。

3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。

注意事项：1、密度梯度离心时，加速度宜慢2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml5、、6、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层7、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温8、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。

pbmc细胞PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）即外周血单个核细胞，包括外周血中的淋巴细胞、单核细胞和浆细胞。

它们在免疫系统中起着重要的作用，对于维持人体免疫反应的平衡至关重要。

本文将介绍PBMC细胞的特点、分离方法以及其在科研和临床应用中的意义。

一、PBMC细胞的特点PBMC细胞是一类具有明显异核的淋巴细胞，包括单核细胞和浆细胞等。

它们存在于外周血液中，由于其特殊的形态结构以及免疫功能，被广泛应用于免疫学研究和临床诊断。

二、PBMC细胞的分离方法PBMC细胞的分离通常采用密度梯度离心法。

具体步骤如下：1. 收集外周血样本，使用抗凝剂稳定血液。

2. 将血液轻轻慢慢倒入离心管中。

3. 加入相应比例的生理盐水或离心液，轻轻混合，保证离心液平稳沉淀。

4. 将离心管置于离心机中，根据不同实验要求选择合适的离心速度和离心时间。

5. 取出离心管，观察离心液的分层情况。

6. 用移液器小心地取出中间的乳状层，该层为PBMC细胞层。

7. 将PBMC细胞层移至新的离心管中，加入培养基进行后续实验或研究。

三、PBMC细胞的应用意义PBMC细胞在免疫学研究和临床应用中具有重要的意义。

1. 免疫学研究PBMC细胞可用于体外实验，研究细胞介导的免疫反应机制，评估不同物质对免疫系统的影响。

例如，通过研究PBMC细胞的细胞因子产生水平，可以评估特定免疫刺激对机体免疫功能的激活情况。

2. 免疫功能评估PBMC细胞可以用于评估疾病患者的免疫功能状态。

通过检测PBMC细胞中各类免疫指标的表达水平，可以评估免疫系统的活性和功能状态，为临床诊断提供参考依据。

3. 细胞治疗PBMC细胞在细胞治疗中也有广泛应用。

例如，通过采集患者的PBMC细胞，经过体外扩增和处理后，再注入患者体内，可以增强患者的免疫反应和抗肿瘤能力，达到治疗的效果。

四、结语PBMC细胞作为外周血单个核细胞的代表，具有重要的免疫学意义。

PBMC的分离物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。

2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。

3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。

注意事项：1、密度梯度离心时，加速度宜慢2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml5、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层6、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温7、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。

实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。

外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。

此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。

【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。

市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。

将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。

【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。

2.5g/L台盼蓝。

3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。

4.Hank,s液。

5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。

6.水平离心机、显微镜。

【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。

再加入等量Hank,s液混匀。

2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。

稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。

3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。

4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。

悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验步骤
5、计算： 细胞数/毫升=（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
• 常 用 于 标 记 的 酶 有 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ horseradish peroxidase, HRP ） 和 碱 性 磷 酸 酶 （ Alkaline phosphatase, AP），它们与抗体结合不影响抗体活性， 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
Enzyme-linked immunoabsobant assays
• 6. 终止：加终止液2M H2SO4 50ul每孔； • 7.检测及绘制标准曲线：于490nm处检测OD值，标准
曲线的斜率：b＝ΣXY/ΣX2,标准曲线Y＝b·X (其中， X：浓度（标准品）；Y：比色OD值的均值)。
• ８.绘制标准曲线后，通过各孔的OD值在标准曲线上 相应位置计算出相应浓度
实验目的
动物免疫
二、细胞抗原
1wk
3wk 5wk 加强
细胞数量8×106/只，洗涤三遍，用0.3~0.4ml的生理 盐水重悬，腹腔注射； 细胞数量6×106/只，细胞的预处理及注射的部位同上； 细胞数量5×106/只，细胞的预处理及注射的部位同上； 融合前的4~5天，细胞数量3×106 /只，加强免疫
在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿瘤 而死亡，故用丝裂霉素（MMC）处理免疫原细胞，抑制其生长繁 殖以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经MMC处理。

pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。

以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。

•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。

•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。

3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。

•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。

•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。

4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。

5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。

6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。

•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。

注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。

•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。

•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。

这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。

刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。

2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。

3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。

4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。

5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。

6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。

7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。

①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。

②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。

细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。

（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。

9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。

（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。

10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。

11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。

人全外周血血浆与PBMC分离
前期准备：离心机降温；
冻存液配制：血清：DMEM:DMSO按5：4：1的比例配制
1.拿到血，配平，500g x4℃离心5分钟，升6降5(加速度);
2. 上清为血浆，取上清分装至冻存管保存至-80℃冰箱；
3.往剩余的血中加入3-4ml PBS稀释血液，取50ml离心管加入15-20ml人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll) ，用胶吸管将血缓慢加入装ficoll的离心管中。

4．400g x20℃离心25分钟，升5降0(加速度);
5.离心完后轻轻吸掉上清，取中间飘浮的一层细胞，加4-5ml PBS，400G离5分钟，升6降5(加速度),
6. （方法同冻细胞）加入3-5ml冻存液，分装至冻存管冻存3-5管，转到程序降温盒，放入-80℃冰箱冻存。

外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。

它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。

因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。

本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。

方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。

以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。

2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。

3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。

一般来说，1200rpm离心10分钟即可。

4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。

5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。

6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。

7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。

8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。

这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。

缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。

方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。

以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。

2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。

3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。

4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。

5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。

6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。

7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。

刘凤君实验步骤1. 采血：抽取初治（初始抗病毒治疗）之前CHB CHC患者外周静脉血6ml ，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。

2. 稀释：室温下加入等体积的 PBS,轻轻吹打混匀。

3. 加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll （淋巴细胞分离液）于离心管中，（ Ficoll 与稀释前血液的体积比为 1:1 ），管倾斜 45°，将稀释后的血液在Ficoll 液面上方约1cm 处沿管壁缓慢加至Ficoll 上面。

4•离心：18-20 C ,2000rpm , 30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。

5. 回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。

6. 洗涤：加入至少于PBMC （外周血单个核细胞）体积3倍的PBS, 18-20C ,2000rpm , 10min，两次。

7. 细胞计数：弃上清，加 1ml RPMI-1640 培养基（含 10%胎牛血清），吹打混匀，制备成 PBMC细胞悬液。

①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2% 台盼蓝，吹打混匀后吸取 1 滴进行细胞浓度测定。

②血细胞计数板：取一滴 PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数 4大格内细胞总数。

细胞数 /ml=4个大方格细胞总数/4 X 104 X 2 （稀释倍数）8. 细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为 2X 105/ml培养基，加于6 孔板或24 孔板中进行培养。

（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。

9. 干扰素处理：加入500IU/ml （培养基的终浓度）的a -IFN （干扰素），同时设对照组，时间为 8 小时。

（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。

10. 细胞收集：将 6 孔板或 24 孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将 Trizol转入EP管中。

大鼠pbmc分离的量1.引言概述大鼠外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）的分离是生物医学研究中常用的技术之一。

PBMC主要由淋巴细胞、单核细胞和少量的自然杀伤细胞组成。

分离PBMC可以提供大量的细胞来进行免疫学研究、细胞培养和药物筛选等实验。

分离大鼠PBMC的关键步骤是通过密度梯度离心的方法来分离淋巴细胞和单核细胞。

在此过程中，外周血液样品中的全血会先经过稀释处理，然后被缓慢地滴加到密度梯度离心管中。

接着，离心管将被放置于离心机中进行高速离心，离心的时间和离心速度会使血液中的不同细胞沉降到不同的位置。

最终，我们可以通过管中的沉淀层将PBMC分离出来。

PBMC分离技术的成功与否对后续实验的质量和准确性具有重要影响。

因此，在进行大鼠PBMC分离之前，需要严格控制实验条件和操作技巧，确保样品的完整性和纯度。

此外，为了增加分离PBMC的收率，也可以调整密度梯度离心液和离心的速度等参数。

总之，大鼠PBMC的分离是一项关键的技术，对于研究和应用免疫细胞生物学具有重要的意义。

通过合理使用该技术，我们可以获得高质量的PBMC，用于进一步的免疫学或临床研究。

（以上为文章1.1 概述部分的内容，仅供参考）1.2 文章结构文章结构部分的内容可以从以下几个方面进行编写：本文将按照以下结构进行阐述：1. 引言：首先，简要概述大鼠PBMC分离的重要性和应用背景，介绍PBMC的定义和重要性，以及本文的目的和意义。

2. 正文：2.1 第一要点：在本部分，详细介绍大鼠PBMC分离的方法和步骤。

包括样本的收集、处理和分离PBMC 的技术原理和步骤。

同时，可对常用的离心分离法、密度梯度离心法和磁珠分离法进行介绍和比较，分析各种方法的优缺点和适用范围。

可以附上操作流程图以方便读者理解。

2.2 第二要点：该部分可进一步探讨大鼠PBMC分离后的应用领域和相关研究进展。

比如，可以介绍在免疫学研究中，大鼠PBMC的应用，如体外诱导成熟巨噬细胞、淋巴细胞增殖实验以及细胞因子的检测等。

Ficoll密度梯度离心法提取PBMC原理及注意事项外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。

PBMC可通过健康人或动物供体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法（IPHASE/汇智和源），磁珠分选等步骤获得。

Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。

红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。

吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

人PBMC中不同细胞类型的比例PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。

这些T细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。

在正常人中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。

同样的B细胞也都处于初始状态。

相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。

干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。

一、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法1.设备与试剂全血（以10ml为例）无菌PBS溶液(pH7.4)或者生理盐水蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)RPMI1640培养基胎牛血清（FBS）双抗P/S（Penicillin/Streptomycin)二甲亚砜（DMSO）预先装好异丙醇的冻存盒2.方法/步骤配制所需的溶液：a.细胞培养基：RPMI1640+10%FBS+1%P/S；b.细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；（1）将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；（2）取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。