人外周血单核细胞分离技术

外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细
胞的重要来源。

其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。

自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞，下层主要为红细胞。

此方法简便但各层中
的细胞种类多，不纯。

血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和
少量红细胞。

下层虽以红细胞为主，但也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。

差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞
形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开。

其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水
浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两
者易于分离开，取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。

此法分离的细胞纯度也不高。

氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。

淋巴细胞中混有的少
量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂解，以排除红细胞的干扰。

另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。

人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。

PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。

为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。

一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。

2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。

3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。

二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。

2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。

3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。

三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。

2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。

3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。

对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。

ficoll分离法分离pbmcFicoll分离法分离PBMC的介绍PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell），又称外周血单个核细胞，是人体免疫系统中重要的组成部分。

PBMC中包含淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等，是研究免疫学、血液学和生物学的重要细胞。

对PBMC的分离和纯化对于后续的实验研究有着至关重要的作用。

其中，Ficoll分离法是常用的PBMC分离方法之一，其通过悬浮PBMC在密度梯度上，利用真核细胞和其它细胞在稀释Ficoll溶液中的胶体压差选择性沉降，从而获得纯净的PBMC。

下面，本文将详细介绍Ficoll分离法分离PBMC的步骤和特点。

一、操作步骤1、制备样本：以抗凝剂抗凝的外周血为样品。

2、制备Ficoll-Paque溶液：5ml Ficoll-Paque液加5ml PBS进行混合。

3、样本的悬浮液：将5ml抗凝的外周血加入到50ml 耐酸碱离心管内。

缓慢倒入Ficoll-Paque溶液，避免两种溶液混合。

装好离心管盖，以3000r/min离心30min（制备不同量的悬浮液时离心的时间不同），过程中不能震动，最好在无扰动的条件下离心。

4、取上清液：离心结束后，可以清晰地看到上清液、白膜和红血块。

样品中的细胞被Ficoll在稀释液中的胶体压力亲和力离心到离心管的木纹间。

无线假底离心管是离心过程中压力拍打细胞下沉粘连的机会最小的离心材料。

在冰上开盖依次取出，将悬浮液上清液倒在装有PBS的无菌离心管中。

5、PBS的加入：加入PBS，摇匀，离心1800r/min，10min。

取出，弃上清液。

6、PBS的加入和离心：重复上一步2次。

最后一次离心弃掉PBS，留下沉淀细胞。

二、特点1、相对纯净度高：Ficoll-Paque是一种密度梯度介质，利用细胞的沉降速度和浮力进行分离。

使不同密度的细胞分层，从而实现分离。

使用该分离方法分离PBMC，可获得高度纯净的细胞，最大限度减少不同细胞系之间的干扰。

ficoll密度梯度离心法是一种常用的细胞分离技术，尤其在分离外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）时被广泛应用。

该技术通过梯度离心的原理，能够将不同密度的细胞分离开来，从而得到高纯度的目标细胞。

本文将从原理、操作步骤及应用方面对ficoll密度梯度离心法分离PBMC进行介绍。

一、原理1. ficoll密度梯度离心法的原理ficoll密度梯度离心法是基于不同细胞在不同密度梯度离心条件下会沉降到不同层级的原理。

ficoll是一种聚合物，在水溶液中形成梯度，形成浓度递增的梯度。

当混有不同密度的细胞悬液样本在ficoll梯度上离心时，密度较高的细胞沉淀到ficoll浓度较高的层次上，而密度较低的细胞则会沉淀到ficoll浓度较低的层次上，从而实现了不同细胞的分离。

2. ficoll密度梯度离心法分离PBMC的原理在分离PBMC时，PBMC是由淋巴细胞和单核细胞组成的一种混合细胞悬液。

在ficoll密度梯度离心法中，PBMC会在ficoll的适当浓度层次上形成特定的固定位置，而其他细胞则会分布在不同的ficoll浓度层次上。

通过调整ficoll梯度的浓度，即可使PBMC在特定位置上沉淀，从而实现PBMC的分离。

二、操作步骤1. 制备ficoll梯度液将ficoll粉末加入等体积的PBS缓冲液中，充分溶解并混匀，得到ficoll梯度离心所需的溶液。

2. 取样、稀释取外周血样本，加入适量的PBS缓冲液稀释，使细胞密度均匀并不超出离心设备的容量。

3. 加样将稀释后的外周血样本缓慢地加入到制备好的ficoll梯度液上，避免产生气泡并保持悬液的均匀性。

4. 离心分离将加样后的离心管放入离心机中，进行高速离心。

离心过程中，细胞会根据密度在ficoll梯度上分层沉淀，形成不同层次的细胞带。

5. 取样离心结束后，用吸管或移液器沿着管壁取下PBMC所在的ficoll层次，并转移至新的离心管中。

外周血单个核细胞分离实验报告一、实验目的本实验旨在通过外周血单个核细胞分离实验，掌握外周血单个核细胞的分离方法及相关技术。

二、实验原理外周血单个核细胞分离是利用密度梯度离心法，将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来。

具体步骤如下：1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。

2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。

3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。

留下沉淀物。

4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。

5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。

由于不同种类细胞密度不同，在经过密度梯度离心后会形成不同层次的沉淀物。

6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。

三、实验步骤1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。

2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。

3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。

留下沉淀物。

4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。

5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。

离心条件为2000rpm，20min。

6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。

四、实验结果经过实验操作后，得到了外周血单个核细胞。

观察镜下可见细胞形态完整、染色质均匀分布、核仁清晰。

五、实验注意事项1. 实验前应认真阅读操作步骤和注意事项，并做好充分准备工作。

2. 操作过程中应保持无菌操作环境，并使用消毒好的器材和试剂。

3. 离心时应注意转速和时间的控制，以避免对细胞造成不必要的损伤。

4. 实验结束后应及时清理实验台和器材，并妥善处理实验废弃物。

六、实验总结本实验通过密度梯度离心法，成功地将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来，得到了单个核细胞。

在操作过程中，需要注意无菌操作环境和离心条件的控制。

通过本次实验，我们掌握了外周血单个核细胞的分离方法及相关技术，为后续的研究提供了基础。

pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。

以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。

•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。

•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。

3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。

•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。

•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。

4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。

5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。

6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。

•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。

注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。

•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。

•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。

这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。

实验预备一．人外周血单核细胞分离1.抗凝血的预离心别离取正常人新鲜抗凝全血A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，取得基层沉淀细胞约10～mL。

2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH ～体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。

B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。

另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液警惕而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。

现在稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。

与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心终止后，掏出离心管，可见管中液体已经分层。

管内可见分为4层：最上层是血浆，含部份血小板：第二层为薄薄的白膜层，要紧台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞那么紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜(图21—3)：3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，搜集血浆层和淋巴细胞分离液交壤面的单个核细胞，尽可能全数吸出PBMC。

加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，幸免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。

混匀后离心1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

注意：还能够先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰着雾状层，然后在把要的部份慢慢吸出来。

第二种方式，比较简单一些。

再用一样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。

再以RPMI-1640 培育基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。

按每毫升血液标本加mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640液3～4 mL) 从头混悬细胞37℃、5% CO2孵育箱中培育2 ～3 h后去除上清，取得贴壁的单核细胞。

ICS 07.080C40 CMBA 团体标准T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, separation and preservation of PBMC from human peripheral blood2020-12-28发布2020-12-28 实施86 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1中国医药生物技术协会团体标准·DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016·T/CMBA 011—2020目 次前言 (87)1 范围 (88)2 规范性引用文件 (88)3 术语和定义 (88)4 总则 (89)5 实验原理 (89)6 实验方法 (89)7 质量控制 (92)参考文献 (93)中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 87T/CMBA 011—2020前 言本文件按GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。

本文件由中国医药生物技术协会归口。

本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。

本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。

88 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1 范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。