人外周血单个核细胞分离液说明书

人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。

下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。

- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。

- 为实验准备足够数量的外周血样本。

2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。

- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。

3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。

- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。

4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。

5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。

- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。

- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。

6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。

- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。

- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。

请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。

在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。

同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。

希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。

人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。

PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。

为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。

一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。

2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。

3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。

二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。

2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。

3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。

三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。

2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。

3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。

对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。

www .tbdscience .com天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 本品只能用于科学研究，不能用于临床检测 天津灏洋华科生物科技有限公司 本品于GMP 标准下生产天津市灏洋生物制品科技有限责任公司◆TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD - 1 -天津滨海高新区华苑产业区（环外）海泰华科一路15号3幢5层技术服务T el: 158****1119 158****1119139****1119◆ QQ:2768676807 ◆E-mail:*********************灏洋生物 TBD sciences 人全血单个核细胞分离液说明书【包装规格】200ml/瓶【实验前准备】1. 适用仪器最大离心力可达1200g 的水平转子离心机2. 抗凝剂的选择在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝 剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验。

为此，天津灏洋特别开发出专利抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管 获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。

3. PBMC 高效离心管（详见PBMC 高效离心管使用说明）【检验方法】全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。

首先根据样本量大小，分以下几种情况：一、 使用15ml 离心管时：情况A ：血液样本量小于3ml 时，实验方法如下：1. 取一支15ml 离心管，加入3ml 分离液。

2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，400-650g ，离心20-30min （注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。

3. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。

第一层为血浆层。

第二层为环状乳白色单个核细胞层。

第三层为透明分离液层。

第四层为红细胞层。

人外周血白细胞分离液使用说明一、试剂的制备1.将人外周血样品采集入采血管中，并将其与抗凝剂轻轻混匀。

2. 采用无菌条件下，将采集的外周血放入离心管中，以2000 rpm的转速离心10分钟。

3.弃去上清液，保留沉淀，注意不要干扰底部白细胞沉积。

4. 向离心管中加入合适体积的分离液，通常建议将1 ml分离液加入约2 ml外周血样品中。

5. 使用离心机以2000 rpm的速度离心10分钟。

6.弃去上清液，并将其中的底泥转移到新离心管中。

7.向新的离心管中加入平衡液，与底泥充分混匀。

8. 使用离心机以2000 rpm的速度离心5分钟。

9.弃去上清液，并将底泥转移到合适的容器中。

10.向底泥中加入适量的培养基，细胞培养基通常是最常用的培养基。

二、试剂的存储1.试剂储存温度通常在2-8摄氏度之间。

2.开封后的试剂，建议在使用之前将其置于室温下适当回温。

3.试剂一旦开封，应避免重复的冻融循环，以防止对试剂活性造成损害。

4.尽量避免接触光线，以防止试剂活性的降低。

三、使用注意事项1.使用前，请确认试剂是否过期，过期试剂不得使用。

3.使用前，应先将分离液均匀搅拌，以保证其活性。

4.在试剂使用过程中，尽量避免受到湿气和阳光的影响。

5.将待提取的外周血样品严格根据提取方法进行操作，以获得高质量的白细胞。

6.在离心过程中，注意离心管的盖子要盖好，防止离心时离心液的外溢。

7.实验过程中，尽量避免反复提取，以避免对白细胞活性造成损害。

8.在培养细胞的过程中，注意细胞培养基的选择和培养条件的控制，以保证白细胞的健康生长。

四、注意事项1.本试剂仅供科研使用，禁止用于临床诊断等用途。

3.请按照相关实验室安全操作规范进行操作，做好个人防护措施。

4.请勿将试剂倒入下水道或垃圾箱中，应根据相关规定进行处理。

总结：通过以上的使用说明，我们可以了解到人外周血白细胞分离液的使用方法以及使用注意事项。

正确和规范使用试剂可以帮助我们获得高质量的分离液和细胞，进一步推动科学研究的进展。

外周血单个核细胞的分离
概述
外周血单个核细胞是一种白细胞。

通过分离单个核细胞，可以进行多种分子生物学实验和临床应用。

本文将介绍两种分离外周血单个核细胞的方法。

方法
密度梯度离心
1.将外周血收集到 EDTA 管中。

2.将 3 毫升 Ficoll-Paque™ PLUS 加入到 15 毫升离心管中。

3.轻轻加入同等体积的外周血到离心管，保持液面平整。

4.以 400g 的速度离心 40 分钟。

在离心温度达到室温前离心室门不得
打开。

5.用温和的力度将上清液吸出到新的离心管中，并在 1200g 的速度下
洗涤 2-3 次。

6.已经分离的单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。

此过程中加入生长
培养基以维持细胞质稳定。

磁性负选择法
1.将外周血收集到 EDTA 管中。

2.加入红细胞淋巴细胞分离液，根据厂家指南染色。

3.加入磁性微珠混合液，使单个核细胞与微珠组合。

4.放入磁场中过滤掉未与微珠组合的细胞及其他血细胞。

5.经过多次洗涤和离心，单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。

此过程
中加入生长培养基以维持细胞质稳定。

密度梯度离心法和磁性负选择法是分离外周血单个核细胞的两种有效方法。

这些方法对于多种分子生物学实验和临床应用都非常有用。

人外周血中性粒细胞分离液试剂盒使用说明货号：P9040规格：2×200mL/kit保存：18℃-25℃保存，有效期两年。

人外周血中性粒细胞分离液试剂盒易感染细菌，需无菌条件下操作。

无菌条件下操作，启封后常温保存。

如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

试剂盒内容：试剂A200mL试剂C200mL清洗液（赠品）200mL红细胞裂解液（赠品）100mL说明书1份操作步骤：情况A:血液样本小于5mL时，实验方法如下：1.取一支15mL离心管，先加入3mL试剂A后加入2mL试剂C，制成梯度界面。

2.用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面之上，400-500g，离心20-30min（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力及离心时间，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。

）3.离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层为单个核细胞，下层细胞为中性粒细胞。

4.用吸管小心吸取分离液中的中性粒细胞层，如有红细胞混杂则加入适量的红细胞裂解液，将红细胞裂解，即得目的细胞。

5.将获得的细胞层移至另一15mL离心管中，向所得离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞。

6.250g，离心10min。

7.弃上清。

8.用5mL清洗液重悬所得细胞。

9.250g，离心10min。

10.重复7、8、9，弃上清后以0.5mL后续实验所需相应液体重悬细胞。

情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下：1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂C（试剂A与试剂C体积比为3:2，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。

2.将血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），离心20-30min。

（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需要客户自己摸索，以达到最佳分离效果。

加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。

第1篇一、产品概述本产品为一种生物医学试剂，主要用于从人血液中分离纯化淋巴细胞。

淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分，广泛用于免疫学研究和临床诊断。

本产品采用特殊的分离技术，能够高效、快速地从人外周血中分离出高纯度的淋巴细胞，为后续的免疫学研究提供高质量的实验材料。

二、产品规格| 产品规格 | 批号 | 有效期 || :-------: | :---: | :----: || 100ml/瓶 | ABC123 | 2025年12月 |三、产品特性1. 高效分离：本产品采用独特的分离介质，能够高效地将淋巴细胞与其他血细胞分离，分离效率高，纯度好。

2. 操作简便：本产品使用方法简单，无需特殊设备，适合实验室常规操作。

3. 稳定性好：本产品在规定的储存条件下，稳定性良好，保质期内质量稳定。

4. 无污染：本产品在生产过程中严格遵循无菌操作规程，产品无细菌、病毒等生物污染。

四、产品用途1. 免疫学研究：用于分离淋巴细胞，进行细胞因子检测、细胞培养、细胞因子基因表达等研究。

2. 临床诊断：用于检测血液中的淋巴细胞，辅助诊断某些疾病，如自身免疫性疾病、肿瘤等。

3. 药物研发：用于药物筛选、药效评价等。

五、使用方法1. 准备工作：- 将分离液室温下平衡至室温。

- 准备无菌试管、移液器、吸头等实验器材。

- 准备适量抗凝剂（如EDTA-K2）。

2. 操作步骤：- 将抗凝全血加入分离管中，轻轻混匀。

- 将分离液加入另一支无菌试管中，加入量约为全血量的2倍。

- 将全血和分离液轻轻混合，避免产生气泡。

- 将混合后的样品垂直静置1-2小时，直至形成清晰的三层界面。

- 小心吸取淋巴细胞层，避免混入其他细胞层。

- 将淋巴细胞转移至新的无菌试管中，加入适量磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，重复洗涤2-3次，以去除残留的分离液和杂质。

- 最后，将洗涤后的淋巴细胞悬浮于适量的PBS中，即可进行后续实验。

六、注意事项1. 操作过程中应严格遵守无菌操作规程，防止污染。

人外周血淋巴细胞分离液使用说明人外周血淋巴细胞分离液（Peripheral Blood Lymphocyte Separation Medium）是一种广泛应用于分离人外周血中淋巴细胞的试剂，被广泛应用于免疫学和生物医学研究领域。

该试剂通过层析技术，可快速、高效地分离出外周血中的淋巴细胞，供后续的分析和实验使用。

一、试剂组成人外周血淋巴细胞分离液的主要成分包括离心管分层缓冲液、细胞分离密度悬液、所需的辅助试剂和脏器灭菌液等。

离心管分层缓冲液的成分通常包含氯化钠、氯化无水亚铁、酵母精、酵母根、胰蛋白水解物、洋葱提取物、N-酰胺毛细管蓝等。

细胞分离密度悬液则通常包含氯化钠、氯化无水亚铁、葡萄糖、胰蛋白水解物等，以及一些辅助试剂如生理盐水、浓度为2%的纯度高粘度明胶等。

辅助试剂方面，常用的有人凝血酶、去细菌酶、维生素C和青霉素等。

脏器灭菌液则是为了确保细胞分离过程中试剂和设备的无菌。

二、试剂使用方法1.准备工作在开始实验前，应准备好所需的实验试剂和设备，并确保所用的所有物品和材料都是无菌的。

同时，应将离心管分层缓冲液和细胞分离密度悬液放在常温下静置30分钟以上。

2.外周血分离取相应容量的外周血标本，在无菌条件下加入带有抗凝剂的离心管中，并轻轻倾转混合均匀，避免凝块形成。

置于无菌离心管架中，以1000-1500r/min离心5-10分钟，离心后分血浆、白细胞层和红细胞层。

3.分离淋巴细胞将离心后的中间白细胞层完全转移至新的离心管中，加入适量的生理盐水进行洗涤，离心1500r/min 5分钟。

倒掉上清液，留下沉淀。

重复该步骤2-3次。

洗涤后，加入等量的细胞分离密度悬液轻轻混合，再次离心。

离心1000r/min 20分钟。

此步骤可以使淋巴细胞充分分离。

4.收集淋巴细胞将分离好的淋巴细胞沉淀取出，加入等量的生理盐水或适宜的培养基中进行悬浮，使淋巴细胞悬浮液浓度适宜。

然后可以根据实验需要进行后续分析和实验操作。

外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！简介周⾎单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

单个核细胞的体积、形态和⽐重与外周⾎其他细胞不同，红细胞和多核⽩细胞的⽐重在1.092左右，单个核细胞的⽐重为1.075-1.090，⾎⼩板为1.030-1.035。

因此利⽤⼀种介于1.075-1.092之间⽽近于等渗的溶液作密度梯度离⼼，使⼀定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种⾎细胞与单个核细胞分离。

分离⼀、基本原理⼆、试剂与器材1、聚蔗糖—泛影葡胺分层液，Hank’s液，RPMI-1640培养液，肝素。

2、⽔平离⼼机。

三、操作步骤1、取外周静脉⾎，⽤肝素抗凝，加等量的Hank’s液并混匀。

2、将分层液加⼊试管中，⽤量约为⾎量的1/2。

⽤吸管沿管壁缓缓将⾎加⼊分层液⾯上。

3、置于⽔平离⼼机离⼼，1500r/min，10min。

可见绝⼤多数单个核细胞悬浮于⾎浆和分层液的界⾯，呈⽩膜状。

4、⽤尖吸管吸取界⾯的细胞层，置于另⼀试管中，加⼊适量的Hank's液，混匀后以1000r/min，离⼼10min，弃上清。

5、同法洗涤细胞2次。

6、将细胞重悬于RPMI-1640培养液中，4保存备⽤。

四、注意事项1、在分离外周⾎单个核细胞过程中，将稀释⾎液加于分层液上时，要避免冲散分层液⾯，⽽要使之形成良好的界⾯，否则影响分离结果。

2、此法操作得当，单个核细胞得率可达80%-90%，影响得率最重要的因素是分层液的⽐重。

淋巴细胞淋巴细胞来源于造⾎⼲细胞(hemopoietic stem cell，HSC)。

造⾎⼲细胞可分化成多能前体细胞( multipotent progenitor cell，MPC)，继⽽分化为淋巴样⼲细胞和髓样⼲细胞。

淋巴样⼲细胞可继续发育为成熟的T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。

⾻髓、胸腺造⾎微环境是造⾎⼲细胞分化发育的主要场所。

单个核细胞单个核细胞是⾎液⽩细胞中具有单个核细胞的⼀个含糊术语。

人外周血白细胞分离液使用说明货号:P8670规格：200ml/kit保存：18℃-25℃避光保存，有效期两年。

启封后置4℃保存，有效期一周。

一、分离方法说明及图例A．取1ml新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液1:1混匀后小心加于1份本分离液之液面上；B.以500g（约1800转/分）离心25分钟(半径15cm水平转子)。

此时离心管中由上至下细胞分四层。

第一层；为血浆层。

第二层；为环状乳白色的白细胞层。

第三层；为略带混浊的分离液层（富集一定量的白细胞）。

第四层；为红细胞层。

弃去第一层血浆层，收集第二层细胞、第三层分离液层和第四层红细胞层，放入含细胞洗涤液10ml的试管中，充分混匀后，以500g 约（1800转/分）离心30分钟。

沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需白细胞。

注：提取率约为80%。

二、红细胞裂解液使用说明红细胞裂解液用于从血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。

不适用于禽类等有细胞核红细胞的裂解。

本裂解液经过无菌处理，分离的细胞可以用于后续的原代培养、细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。

使用说明：A.对于组织细胞样品：a.新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。

b.加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。

如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。

c.400-500g离心5分钟，弃红色上清。

4℃离心效果更佳。

d.如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。

通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

e.洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。

可再重复1次，共洗涤1-2次。

洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。

4℃离心效果更佳。

f.根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

人外周血淋巴细胞分离液使用说明货号：P8610规格：200ml保存：室温避光储存，有效期至少2年。

产品简介：外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090g/ml，血小板为1.030～1.035g/ml。

为此，将葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合，调整比重、pH值和渗透压，经过澄清及过滤除菌后制成一种密度在1.077g/ml并且近于等渗的溶液（分层液），经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

人外周血淋巴细胞分离液为带有乳光或微乳光的注射水溶液，主要组成成份是葡聚糖（右旋糖酐）与泛影酸葡甲胺。

适用于从人抗凝血液中分离单个核细胞（主要为淋巴细胞），无菌条件下所分离的细胞可用于免疫学检测。

分离液法说明及图例：取新鲜抗凝血1ml，与生理盐水1:1混匀后，小心加于2ml细胞分离液之液面上；以400g（约1500转/分，半径15cm水平转子）离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。

第一层：为血浆层。

第二层：为环状乳白色淋巴细胞层。

第三层：为透明分离液层。

第四层：为红细胞层。

收集第二层细胞放入含生理盐水4-5ml的试管中，充分混匀后，以400g （约1500转/分）离心20分钟。

沉淀经2次洗涤后即得所需淋巴细胞。

注：提取率约为80%。

注意事项：A．本分离液要求血液为新鲜抗凝血，避免冷冻和冷藏；在收集血液和分离过程中，应注意无菌操作，避免微生物污染。

B．本实验要求，在正常大气压下，分离液、分离样本以及分离环境温度为20℃±2℃。

分离液在低温时呈较高密度，在高温时呈较低密度。

细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，操作前可将样本和分离液置于20℃水浴中复温20分钟以保证分离温度。

C．由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。

细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK ）专用试剂盒说明书中关村三有利再生医学研究中心简介细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced Killer Cells ，CIK ）是将人体外周血或脐带血单个核细胞在体外经过多种细胞因子共同诱导而获得的一群异质细胞。

由于采用不同的细胞分离和扩增技术，可能得到的结果有较大差异。

按2003年中国药品食品监督管理局发布的《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，规定人体细胞培养中“不得使用同种异体人血清或血浆。

如果必须使用动物血清，应考虑每批血清都应对潜在的外源因子（包括人的病原体）进行检查、筛查。

”常用的人CIK 细胞培养方法绝大部分是采用胎牛或新生小牛血清培养体系。

由于血清批间的差异，不同实验培养的CIK 细胞差异较大。

我们通过筛选优质的新生牛血清，建立了经济实用、安全可靠的人CIK 细胞培养体系。

北京三有利科技发展有限公司推荐以下研究用培养体系：即采用SANLY 人CIK 细胞培养体系操作简单明了，细胞增值倍数高，CD3和CD56双阳细胞比例高。

培养至14天，检测细菌真菌培养阴性；台盼兰拒染试验活细胞>95%。

在第16、17、18天，取1*105个细胞做流式检测细胞亚型，并收集细胞悬液离心去上清后，用生理盐水洗涤3次，最后将细胞悬于200-300ml 含1%白蛋白的生理盐水中备用。

CIK专用试剂盒使用说明外周血单个核细胞（PBMC）分离1.取血细胞分离机采集的外周血或脐带血单个核细胞，加入等体积生理盐水，充分混匀。

2.将上述外周血与1号试剂按照4：1的比例加入50ml离心管内，充分混匀，4℃静置15-20min。

3.40G，4℃离心5min，缓升缓降（without breaking）。

4.取上清，加入到50ml离心管中，用生理盐水补到50ml，400G，4℃，离心10min。

(更改:淋巴细胞分离液)5.弃上清，加入生理盐水至50ml，混合均匀，400G，4℃，离心5min，相同条件共洗涤3次。

ICS 07.080C40 CMBA 团体标准T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, separation and preservation of PBMC from human peripheral blood2020-12-28发布2020-12-28 实施86 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1中国医药生物技术协会团体标准·DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016·T/CMBA 011—2020目 次前言 (87)1 范围 (88)2 规范性引用文件 (88)3 术语和定义 (88)4 总则 (89)5 实验原理 (89)6 实验方法 (89)7 质量控制 (92)参考文献 (93)中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 87T/CMBA 011—2020前 言本文件按GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。

本文件由中国医药生物技术协会归口。

本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。

本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。

88 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1 范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。

外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。

它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。

因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。

本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。

方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。

以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。

2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。

3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。

一般来说，1200rpm离心10分钟即可。

4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。

5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。

6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。

7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。

8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。

这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。

缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。

方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。

以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。

2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。

3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。

4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。

5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。

6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。

7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。

单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
1.取外周血20mL，转移至250mL无菌生理盐水瓶中，加20mL生理盐水混匀，按照体积比3：1加入羟乙基淀粉，即加入13.5mL羟乙基淀粉，充分摇匀后，室温静置15min。

此时加上操作，一共需要耗时25min。

2.吸取上层清亮溶液至50mL无菌离心管，20℃，1800rpm，离心5min，弃上清，最后用10mL生理盐水重悬细胞。

此时加上操作，共耗时25min。

3.吸取提前预热至室温的Ficou人淋巴细胞分离液10mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁缓慢加入到分离液中，室温，2000rpm离心25min。

此时加上操作，共耗时35min。

4.小心吸取中间白膜层置于另一无菌15mL离心管，加生理盐水补足体积至
13mL，吹打混匀，室温，1800rpm离心5min，弃上清液，然后再重复该步骤1次。

此时加上操作，共耗时20min。

5.用500微升生理盐水重悬，稀释100倍进行细胞计数，吸取合适数量的细胞进行流式标记（共分为23个流式标记管，至少需1.15×107细胞），每管50微升孵育体积，每种抗体加入1.5微升，全部加完后用中枪混匀，放于4度冰箱孵育30min，并每10min弹匀一次。

此时加上操作，共耗时80min。

6.取出孵育完毕的抗体，用PBS清洗两次（2000rpm离心5min），最后用200微升PBS重悬。

此时加上操作，共耗时40min。

7.将样品拿至流式检测室过筛网，上机检测。

此时加上操作，共耗时45min。

8.关机及出流式报告，30min。

分离后分离前 水平离心血浆层 单个核细胞层 分离液层红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书：P9010/P9011200mL本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。

外周血中单个核细胞（PBMC ）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090 g/mL 左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/mL ，血小板为1.030~1.035 g/mL 。

为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

密度 1.077±0.001g/mL渗透压 290~350 mOsm/kg H2O无菌 0.1μm 滤膜过滤本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。

无菌开封后，保存于室温。

1. 取新鲜抗凝全血（EDTA 、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS 稀释全血。

2. 在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL 时，加入3mL 分离液；大于等于3mL ，加入等体积分离液。

但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。

（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。

如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。

）3. 室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min （血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g ）。

4. 离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。

样本密度分离液说明书【产品名称】通用名称：样本密度分离液英文名称：Density Reagent【型号】样本密度分离液（A型）样本密度分离液（B型）【规格】100mL/瓶、250mL/瓶【预期用途】通过密度分离作用，用于样本中不同成分的分离，以便于对样本的进一步分析。

【检验原理】外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090g/ml之间，红细胞及粒细胞的密度较大，为1.092g/ml左右，血小板在1.030～1.035 g/ml之间。

因此利用样本密度分离液产生一定程度的密度梯度，将稀释后的全血平铺于分离液之上。

离心后，红细胞、粒细胞比重大，沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液比重，漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。

吸取分离液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

【主要组成成分】本产品的主要成份为聚蔗糖和泛影酸。

【储存条件及有效期】未开封室温避光保存，有效期为2年；开封后4℃保存，保质期为6个月。

【样本要求】要求血液为新鲜的抗凝血，血液收集时应无菌操作且在储存、运输、处理过程中避免冷冻。

【检验方法】1.取新鲜抗凝（EDTA、枸橼酸钠或肝素等抗凝剂均可）全血，用等体积等渗溶液（PBS或生理盐水）稀释全血。

2.在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。

分离液、抗凝未经稀释全血、等渗溶液（PBS或生理盐水）体积为1:1:1。

3.室温，水平转子700-800g离心20-30min。

设置较慢的升降速（如果共有十档且第十档为最高档，升降速应该调整到第三档）。

4.离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄较致密的白膜，即：单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）层。

小心吸取白膜层到另一离心管中。

5.用等渗溶液（PBS、生理盐水或培养基等）稀释到一定体积，颠倒混匀。