RTPCR方法检测慢性粒细胞白血病bcrabl融合基因类型

Bcr／abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的检测方法及意义bcr/abl 融合基因是慢性粒细胞白血病（CML）发病的分子生物学基础，通过灵敏的检验方法检测此基因对CML的诊断、治疗和预测疾病复发等具有重要临床意义。

标签：bcr/abl 融合基因；慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病（CML）是一种发生在造血干细胞的以粒系细胞慢性增殖为主要特征的恶性克隆性疾病，分子学水平上形成bcr/abl融合基因。

bcr/abl 融合基因的表达水平反映了患者体内白血病细胞的负荷量。

因此，精确检测bcr/abl融合基因的表达水平，对白血病的临床分型诊断、个体化治疗方案的制定、治疗效果监测、缓解后复发风险的估计和预防、干细胞移植后残留细胞的检测和早期干预治疗等方面具有重要的指导作用。

本文对bcr/abl融合基因的检测方法及意义进行综述。

1 Bcr/abl融合基因的检测方法1.1 Southern Blot和Western BlotSouthern 印迹即DNA印迹，可以对bcr/abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。

Southern Blot可使用从外周血或骨髓细胞提取的DNA对bcr/abl融合基因进行检测，不需要保持细胞的活力和所处周期，灵敏度约1～5%，多适用于科研而不是临床诊断[1]。

Western 印迹的原理类似Southern印迹，它是从混合蛋白质中区分并定量分析某种特殊蛋白质的重要手段[2-3]。

但由于不同蛋白质的电转移效率以及单抗的结合能力不同，Western印迹的敏感性和可重复性较差，其敏感性为0.5%～1%[4]。

另外该法操作繁琐、检测时间长，限制了其在临床上的应用。

1.2 常规RT-PCR1988年RT-PCR被首次应用于CML的bcr/abl基因的检测[5]。

在RT-PCR中，应用随机引物或abl特异引物，mRNA被反转录为cDNA，随后应用针对M-bcr 的bl或b2和abl的a2或a3的引物进行扩增，扩增产物在琼脂糖或聚内烯酰胺凝胶电泳中出现特异的条带，在典型的CML病例中，b3a2和b2a2扩增产物条带相差75bp。

双色荧光原位杂交检测慢性粒细胞白血病的bcr/abl融合基因自1984年发现了慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)具有bcr/abl融合基因［1，2］，检测bcr/abl融合基因就成为诊断CML的关键。

Tkachuk等［3］使用间接标记的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术检测bcr/abl融合基因。

应用FISH技术比逆转录聚合酶链反应(reverse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)及细胞遗传学技术更加可靠和灵敏地检测出CML和部分急性淋巴细胞白血病患者的bcr/abl融合基因［4，5］。

我们应用双色荧光原位杂交(dual-color FISH，D-FISH)技术，检测15例CML患者的骨髓染色体标本和骨髓涂片bcr/abl融合基因。

1对象和方法1.1对象(1)病例组：CML的临床诊断及分期标准参照文献［6］进行。

Ph染色体阳性的CML病例共15例，其中，男性13例，女性2例，年龄20～63岁，平均39±13岁。

各病例的骨髓染色体检查结果见表1。

(2)阴性对照组：7例，平均年龄为40±14岁，与病例组年龄无显著差异(P＞0.05)。

其中，正常人2名，另外5例分别为早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、全血细胞减少、继发性粒细胞减少、恶性淋巴瘤患者，细胞遗传学检查无Ph染色体及其它染色体畸变。

(3)材料：15例采用骨髓细胞染色体标本，其中3例还采用了骨髓涂片标本。

两名正常人取外周血染色体标本进行杂交检测。

表1实验组15例CML的细胞遗传学和D-FISH资料*仅有3例患者做了骨髓涂片检查1.2方法1.2.1标本处理(1)骨髓染色体制备：无菌条件下抽取骨髓0.5～0.8ml，分成两份放入含有20%小牛血清的1640培养液中，置于37℃进行短期培养。

BcrAbl融合基因荧光定量RTPCR诊断试剂盒说明书一、试剂盒采纳荧光定量RT-PCR方法，快速、特异、灵敏、定量地检测临床白血病标本中PML/RARα融合基因的情形, 约有90%的急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞和血细胞中会显现PML/RARα融合基因。

因此检测PML/RARα融合基因已成为诊断急性早幼粒细胞白血病以及治疗后追踪残余白血病细胞的要紧依据。

二、试剂盒组成(20人份)RNA提取液（20ml /瓶）1瓶Taq酶（40μl /管）1管反应液I （165μl /管）1管定量标准品（50μl /管）8管反应液II （165μl /管）1管DEPC H2O （500μl /管）1管反应液Ⅲ（350μl /管）1管去离子水（1100μl /管）1管逆转录酶（25μl /管）1管三、检测步骤1．标本采集抽取外周血5ml抗凝后密封送检，或3ml新奇骨髓标本密封送检。

2．标本处理将5ml抗凝外周血或3ml骨髓加入等体积生理盐水稀释，取10ml离心管，先加入2ml淋巴细胞分离液，再取稀释好的标本5ml沿管壁缓慢加入，4℃静置5分钟后，2,000rpm离心15分钟，小心吸取白细胞层于1.5ml离心管中，离心留沉淀，用生理盐水洗沉淀一次，沉淀加入0.5ml RNA提取液，充分混匀。

室温静置5分钟，加入0.2ml氯仿，盖上管盖，用力振摇15秒，4℃静置2-3分钟，4℃12,000rpm离心15分钟，离心后反应管分三层，底层为微黄色的氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层的体积一样为提取液体积的60%。

小心将上层水相转移至灭菌的离心管中，加等体积异丙醇4℃静置10分钟，然后4℃，12,000rpm离心10分钟，离心前通常看不见RNA沉淀，离心后可见胶状沉淀。

去上清，加入400μl 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃7,000 rpm离心5分钟，小心吸去大部分乙醇。

将沉淀在室温空气中干燥10分钟。

(注：75% 乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O）。

实时荧光定量聚合酶链反应法监测慢性髓系白血病外周血 BCR-ABL 融合基因水平的价值研究作者：陈喜填夏维林郑小玲吴桂香来源：《中国当代医药》2019年第01期[摘要]目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法监测慢性髓系白血病（CML）外周血 BCR-ABL融合基因水平的价值。

方法选取2016年3月～2017年6月我院血液科收治的CML患者35例，应用qRT-PCR法检测患者的BCR-ABL融合基因水平，并监测不同疾病分期患者BCR-ABL转录水平，动态监测不同BCR-ABL融合基因水平组患者伊马替尼的治疗效果及无病生存期（DFS），患者治疗前后的BCR-ABL转录水平变化。

结果急变期患者的BCR-ABL转录本水平明显高于加速期和慢性期，加速期患者的BCR-ABL转录本水平明显高于慢性期，组间两两比较差异均有统计学意义（F=4.68，P=0.00）。

疗效满意方面：低水平组与中水平组患者比较，差异无统计学意义（P>0.05），但两组均明显高于高水平组，差异有统计学意义（P[关键词]实时荧光定量聚合酶链反应;慢性髓系白血病;外周血;BCR-ABL融合基因[中图分类号] R733.72; ; ; ; ; [文献标识码] A; ; ; ; ; [文章编号] 1674-4721（2019）1（a）-0011-05慢性髓系白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）是临床常见的造血干细胞恶性肿瘤疾病，其发病机制为22号染色体的长臂与9号染色体的短臂相互易位t（9;22）（q34;q11）形成特征性Ph染色体，分子水平表现为BCR-ABL融合基因形成，并通过BCR-ABL蛋白导致CML发病。

CML起病缓慢，其病程可分为无症状期、慢性期（chronic phase，CP）、加速期（accelerated phase，AP）和急变期（blastic phase，BP），随着病情发展，患者可出现脾大、发热、贫血、出血、胸骨压痛等临床症状[1-3]。

BCR/ABL融合基因检测——CML诊断“黄金标准”1 1 11对照阴性杂交结果图（2R2G）BCR/ABL（DF）典型阳性图（1R1G2F）BCR/ABL（SF）典型阳性图（1R1G1F）BCR/ABL（ES）典型阳性图（2R1G1F）慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia, CML)是一种起源于造血干细胞的克隆性骨髓增殖性肿瘤，主要累及粒细胞系，表现为持续、进行性外周血白细胞数量增加，分类中出现不同分化阶段的粒细胞，尤其以中性粒细胞增多为主，90%以上患者白血病细胞中有恒定的、特征性的Ph染色体及其分子标志BCR/ABL融合基因。

本病发病率较高，可见于各年龄组，以20～50岁多见，诊断时中位年龄为45～50岁。

CML起病缓慢，初期症状不明显，逐渐出现乏力、低热、盗汗、食欲减退及消瘦等。

其自然病程是由慢性期进展为加速期，最后发展为急变期，急变后患者常在3～5个月内死亡。

CML患者中易位类型绝大多数为t(9;22)(q34;q11)的典型易位，少数有变异易位，包括22号与非9号染色体间的简单变异易位，3条或更多条染色体间的复杂易位（隐匿易位）。

易位形成的Ph染色体是由位于9q34的ABL原癌基因断裂并易位到22q11的断裂点簇集区BCR形成，并在断点处形成BCR/ABL融合基因。

该基因可转录出一个8.5kb的异常mRNA，最终翻译成210KD蛋白质（P210)。

P210具有较强的酪氨酸蛋白激酶活性，可通过多种信号传导途径来活化癌基因和某些细胞因子，最终导致细胞的恶性转化。

典型易位（NCCN Guidelines for patients TM Version 1.2011）BCR/ABL融合基因检测意义：1.CML辅助诊断90~95%CML患者可检测出典型的t(9;22)(q34;q11)易位，约5%的CML患者通过核型分析难以检测到Ph染色体，但可检测出融合基因存在，仍被归为Ph+ CML分类。

应用实时定量RT-PCR检测bcr-abl融合基因的表达
刘金香;刘俊立;王冠军
【期刊名称】《癌症（英文版）》
【年(卷),期】2006(025)011
【摘要】背景与目的:白血病患者经诱导化疗达完全缓解时髓外某些隐蔽处仍残存白血病细胞,这是白血病复发的根源.为了彻底治愈白血病,不仅要及时发现残存的白血病细胞,还要对其进行定量监测,以指导治疗和判断预后.本研究旨在建立检测bcr-abl融合基因的实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)体系,并采用此方法对bcr-abl融合基因进行定量分析.方法:通过RT-PCR扩增K562细胞bcr-abl融合基因,用T-A克隆法构建重组质粒作为标准品.绘制出bcr-abl的标准曲线,并对16例慢性粒细胞白血病患者骨髓标本进行bcr-abl融合基因进行定量.标定RT-PCR反应的敏感性、稳定性和重复性.结果:检测到10个拷贝的重组质粒.重复性及稳定性验证结果表明,Ct值变异系数分别为2.19%和3.21%,标准曲线的回归系数为
0.984.16例慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因表达量的中位数为
4.58×104kb/μg RNA.结论:实时定量RT-PCR具有高敏感性、重复性、特异性和稳定性,可以对bcr-abl融合基因进行定量监测.
【总页数】3页(P1447-1449)
【作者】刘金香;刘俊立;王冠军
【作者单位】吉林大学第一医院,血液科,吉林,长春,130021;吉林大学第一医院,血液科,吉林,长春,130021;吉林大学第一医院,血液科,吉林,长春,130021
【正文语种】中文
【中图分类】R733.72
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慢粒白血病患者要定期做PCR检测慢粒白血病（Chronic Myeloid Leukemia, CML）是一种骨髓性白血病，其中骨髓中的粒细胞发生异常增殖。

CML患者需要定期进行多种检查，其中PCR（聚合酶链反应）检测是一项重要的检测技术。

本文将详细介绍慢粒白血病患者为什么需要定期进行PCR检测以及PCR检测的原理和步骤。

慢粒白血病患者需要定期进行PCR检测的原因有以下几个方面。

首先，PCR可以帮助监测慢粒白血病的进展情况。

通过定期检测白血病细胞（BCR-ABL1融合基因）的存在和数量，可以评估患者的疾病状态以及治疗效果。

其次，PCR可以帮助判断治疗方案的调整时机。

如果PCR检测结果显示融合基因的数量明显增加，说明患者的疾病可能复发或进展，需要及时调整治疗方案来控制病情。

此外，PCR还可以检测患者是否存在耐药突变。

一些慢粒白血病患者在长期使用靶向治疗药物（例如伊马替尼）后，可能会产生耐药突变，导致治疗效果下降。

通过PCR检测，可以及早发现这些突变并及时调整治疗。

PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于DNA模板的体外扩增技术，能够通过复制特定DNA片段的过程来扩增目标DNA序列。

PCR检测主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。

首先是变性步骤。

在这一步，样本中的DNA双链被加热至95°C，使其变性成两条单链。

这种变性可以打断所有DNA链之间的氢键，使其解开成为两条单链。

接下来，将样本降温至50-60°C，使引物能够与目标DNA序列的互补链结合。

接下来是延伸步骤。

在这一步中，将DNA聚合酶（DNA polymerase）加入反应体系中，它能够识别引物与DNA模板的结合部位，并在引物的3'端引导下合成新的DNA链。

延伸过程需要在55-75°C下进行。

最后是退火步骤。

在这一步中，将反应温度降至37°C，使引物从目标DNA上退离下来，为下一轮PCR循环做准备。

结果一、两型ＢＣＲ．ＡＢＬ融合基因ｅＤＮＡ的获得用我室常规引物（上游引物Ａ，下游引物Ｂ）进行Ｒ，Ｉ二ＰＣＲ，所得ｂ３ａ２及ｂ２ａ２型融合基因的扩增产物分别为２００ｂｐ和１２５ｂｐ的片断．如图２所示，第二二泳道示ｂ３ａ２型，第三泳道示ｂ２ａ２型。

ＨＬ．６０细胞总ＲＮＡ及超纯水作为双阴性对照。

ｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｔｗｏｔｙｐｅｓｏｆＢＣＲ／ＡＢＬｆｕｓｉｏｕＦｉｇ２１２％ＰＡＧＥｇｅｎｅ．ＤＮＡＩｎａｒｋｅｒ：ｐＢＲ３２２／Ｍｓｐｌ；ＬａｎｅＩ：ＩＩＬ６０ＲＮＡａｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ｏｆｂ２ａ２ｔｙｐｅ；Ｌａｎｅ２：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｂ３ａ２ｔｙｐｅ；Ｌａｎｅ３：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔＬａｎｅ４：ｗａｔｅｒａｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒ０１．５－、ＰＣＲ突变产物的鉴定１．限制性内切酶酶切鉴定：两型融合基因及其突变ＰｃＲ产物经Ｅａｅｌ酶孵育后电泳结果如图３所示ａ在所扩增的野生型ＢＣＰＵＡＢＬｍＲＮＡ片断的ＡＢＬ侧有唯一的一处Ｅａｅｌ酶切位点，构建突变型引物时在该位点处删除了４个碱基，敝突变产物不能被此酶切开。

Ｆｉｇ．３ＥｎｄｏｎｕｅｌｅｏａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｔｗｏｔｙｐｅｓｏｆＰＣＲｍｕｔａｉｌＩｓＴｈｅａｂｌ—ｅｎｄｓｏｆａ３１ｂｐ’Ｓｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｗｉｄｅｔｙｐｅｂ３ａ２ｏｒｂ２ａ２ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｃｏｕｌｄｂｅｄｉｇｅｓｔｅｄｏｕｔＷｉｔｈＥａｅｌ，（ｓｈｏｗｎｉｎｌａｎｅＩａｎｄｌａｎｅ２）ＷｈｉｌｅＥａｅｌｓｉｔｅｓａｒｅｄｅｓｔｒｏｙｅｄｉｎｉｉｍｔａｎｔｓ，ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｒｅｍａｉｎｔｈｅＳａｌｌｌＣａｆｔｅｒｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（１ａｌｉｅ３ａｎｄｌａｎｅ４）ＤＮＡｍａｒｋｅｒｕｓｅｄｉｎｌｅｆｔｓｉｄｅｉｓｐＢＲ３２２／Ｍｓｐｌ，ｉｎｒｉｇｈｔｓｉｄｅ，ｐＢＲ３２２／Ｈａｅｌｌｌ２．毛细管电泳鉴定：经限制性内切酶鉴定过的两种突变型ＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－＇１１质粒并转化大肠杆菌，我们将这阿型质粒分别称为ＪＢｌ９６和ＪＢｌ２１。