promega 小提质粒提取说明书

E.Z.N.A Plasmid Miniprep Protocol 质粒小规模提取试剂盒Product Number D6942 and D6943,D6944注意：1．使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存2．加60ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.室温保存除试剂盒外还需准备：可达到13000×g的离心机无核酸酶的离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)：1.在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml LB培养基LB（含氨苄青霉素50μg/ml），37cº振荡培养12-16h。

需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.2. 取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1min，去上清3. 加250µl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。

（用移液枪吹打进行重悬浮）4.加入250µl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。

最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。

(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)5.加350µl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀6.室温13000×g离心10min，紧凑的白色沉淀就会形成，迅速进行到下一个步骤7.特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。

要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。

室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱8.弃滤过液，加500µl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度以备后续试验使用。

如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略9.弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750µl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min，弃过滤液。

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(中文翻译版)1、将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10~15ul基础培养基/氨苄西林培养介质的50ml培养瓶中。

2、室温下500×g离心10min。

3、弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的SolutionⅠ/RNase A，彻底混匀。

4、将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ul SolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min（混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降）。

5、向4中液体加入250ul预冷的Buffer N3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min（可室温，最好4℃）（Buffer应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的）。

6、小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1的比例向上清液中加入ETR Solution 混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀（加入ETR Solution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清）（勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETR Solution将悬浮于溶液中）。

7、将6中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。

室温下12000×g离心3min，ETR Solution 将于离心管底部形成蓝色层。

8、将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水乙醇（室温，96~100％），轻柔混匀，室温下孵育1~2min。

9、将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。

10、重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。

11、将500ul Buffer HB加入柱子中，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中废液（目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的）。

Promega全血DNA小量提取试剂盒DNA抽提SOP1、实验场所：分子生物实验室（暂定）2、实验着装：隔离衣，塑胶手套3、实验准备：耗材：高压灭菌的黄、蓝tip和1.5mL离心管架仪器：已校准移液器（100，200，1000uL）、高速离心机、振荡器试剂：Promega全血DNA小量提取试剂盒、异丙醇、70%乙醇4、实验步骤：1）从4℃冰箱中取出装有全血的抗凝管，上下颠倒3次混匀，静置待上方盖的血液流下。

2）用镊子取N个1.5mL EP管（N=预抽提DNA血样数）垂直放于EP管架上，用防水marker笔按DNA编号在管壁和管盖上做好标记，并在DNA抽提实验记录本上对应记录血样编号、姓名及DNA编号。

保持EP管盖打开。

3）用1mL移液器取900uL cell lysis solution加入已备好1.5mL EP管中。

4）打开抗凝管盖，取300uL全血（注意勿沾血于移液器上），转移到上述1.5mL EP 管中。

每取一个血样，换一个tip头。

5）盖上EP管，室温下孵育10min。

6）室温下13000转/min离心20秒（不可延时）。

7）取出后，观察下方白色小斑块沉淀，如有则继续下一步，没有则再离心20秒。

8）打开EP管盖，手捏EP管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，因表面张力无法弃去所有红色上清，抬高EP管，注视白色斑块，用100 uL移液器在不碰到白色斑块的前提下，尽量将红色上清吸尽。

9）盖上EP管，用手指弹EP管底物，将白色斑块重悬。

10）加300uL Nuclei Lysis Solution入上述EP管中，盖上EP管，上下颠倒10次混匀。

11）打开EP管，加100uL Protein Precipitation Solution入上述EP管中，盖上EP管，振荡器上振荡20秒。

12）室温下13000转/min离心3min。

13）在离心时，准备N个新的已消毒1.5EP管于管架上，标记DNA编号于管壁和管盖上。

PromegaDNA提取试剂盒的使用方法一、使用前的准备工作Proteinase k solution:用无核酸酶的水把蛋白酶K稀释成20mg/ml，按照自己的每次平均使用量分装，储存在-20℃，融化时要在冰上融化，反复冻融会降低Proteinase K的活性消化液配制：在tube中混合下面各种反应物，使用前放在冰上。

Wizard SV Wash solution（洗脱液）的配制：按照瓶子标签上要求的量，添加95%的乙醇到Wizard sv solution 中，做上标记，室温保存。

PromegaDNA提取试剂盒的使用方法步骤（离心机法）0、将Nuclease-Free Water 放在65℃的水浴锅中1、剪取动物组织20mg，分成相同的2份，放在1.5ml的离心管中，样品中决不能含有软骨组织，否则会阻塞柱子2、每份样品中添加275ul先前准备的消化液，确保消化液能够完全覆盖样品，如果不能覆盖，将样品再剪得小点3、把样品放到55℃的水浴锅或加热块中孵育16-18小时（过夜），蛋白酶K消化过夜后2000g离心，取上清液到1.5ml的离心管中。

4、向样品中添加250ul的Wizard SV Lysis Buffer,漩涡混匀5、处理后的产物尽快进行下面的操作，如果不能进行下面的操作，应该把它放在-70℃下保存，使用时应该冻融或者放在55℃温和解冻6、将收集管做上标记，将柱子放在收集管上，把整个1.5ml离心管内的溶解产物转移到柱子中。

13000g离心3分钟，目的是让基因组吸附在柱子中，如果仍有残留液体，可以重新13000g离心一分钟7、倒掉收集管中的液体，把柱子重新放回收集管上8、检查一下乙醇是否已经添加到Wizard SV Wash Solution中9、每个样品中添加650ul的Wizard SV Wash Solution（真空抽滤要加800ul），13000离心1分钟10、去除溶液，将柱子重新放置在集合管中11、重复9-10步3次，（一共需要洗4次）12、洗剂结束后，清空收集管中的水13000g离心2分钟13、去掉收集管，取相同数量的1.5ml的离心管做上标记，将柱子将在 1.5ml的离心管上，添加250ul65℃的Nuclease-FreeWater 到柱子中，室温孵育2分钟，13000g离心1分钟（要溶液，勿扔）14、再在柱子中添加250ul的Nuclease-Free water，室温孵育2分钟，13000g离心1分钟15、扔掉柱子，将收集的纯化的DNA储存在-20℃至-70℃。

质粒小提实验步骤这个操作方案可以从过夜培养的1.0-5.0 ml 培养物能得到5-30 μg 的高拷贝数的质粒或1-10 ug低拷贝数的质粒DNA。

如果需要提高低拷贝数质粒的产量，按下面的低拷贝数的方案。

1. 将带有目的质粒的E.coli 接种于裝有5 ml LB/氨苄青霉素的10-20ml 的培养管，37℃搖床培养12~16 h，以扩增质粒。

用一个10-20ml 培养管或培养瓶，其体积至少有培养基的4 倍。

建议使用endA 敏感型的E. coli 菌株来作常规质粒的分离，例如DH5α®和JM109®等菌株。

2. 取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。

3. 倒出或吸出培养基，弃去。

往沉淀中加入250 μlSolutionⅠ/RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。

细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。

4. 往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。

如有必要，可把裂解液置于室温静置2min，避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA 断裂而使得到的质粒纯度降低。

裂解反应不要超过5min。

（当使用完SolutionⅡ以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空气中的CO2 反应。

）5. 往上述混和液中加入125 ul 冰浴Buffer N3，并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。

6. 室温下，≥12000 x g 离心10min。

7. 小心将上清倒入干净的1.5ml 离心管中，加入0.1 倍体积的ETR 溶液（蓝色）至上清液中，颠倒试管7-10 次，然后于冰浴中静置10 min。

注意：在加入ETR 溶液后，裂解液可能出现浑浊，但冰浴后将逐渐转为澄清。

8. 将上述裂解液于42℃下静置5 min。

裂解液又将再次出现浑浊。

此时，立即于25℃ 12，000 x g 离心3min，ETR 溶液将在试管底部形成蓝色分层。

质粒小提试剂盒提取质粒
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
（2）取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清；
（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
（4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
（5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm离心10分钟，此时在离心管中底部形成沉淀；
（6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
（7）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
（8）重复操作步骤（8）；
（9）将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液除去；
（10）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。

promega质粒提取试剂盒操作说明（中⽂）注意:所有纯化和洗脱步骤均在室温下进⾏。

1. 将转化⼤肠杆菌细胞在最佳培养条件下培养50-250ml过夜(16 - 21h)。

注意:本⽅案优化为过量培养50-250ml，OD600 = 2-4。

2. 将细菌收集起来，5000 g离⼼10分钟，弃上清。

⽤纸⼱除去多余的介质。

表1 解液所需的溶液体积。

3. 在细胞重悬液中重悬细菌。

4. 加⼊细胞裂解液和轻轻混合翻转管3-5次或混合裂解液轻轻滚动。

室温下孵育3分钟。

注:如果细胞裂解液过冷，可能会发⽣SDS沉淀，导致细胞裂解不良。

如果有沉淀形成，将细胞裂解液加热到37°C，并轻轻摇晃。

5. 在溶解细胞中加⼊中和液，盖住并轻轻翻转5-10次。

6. 15000g室温离⼼15分钟。

这种离⼼法将使颗粒化⼤量的细菌碎⽚。

使⽤PureYield™清除柱清除剩余碎⽚。

要区分PureYield™Clearing和PureYield™Binding列，请注意过滤管是蓝⾊的，⽽结合柱是⽩⾊的。

7. 通过在PureYield™顶部嵌套⼀个PureYield™(蓝⾊)组装。

如图1所⽰，将组装好的柱堆放在真空泵上。

图1所⽰。

蓝⾊清除列插⼊⽩⾊绑定列。

8. 将澄清的裂解液倒⼊PureYield™澄清柱中。

不要让颗粒状的碎⽚落⼊管内。

9. 启动真空泵。

裂解液将通过PureYield™澄清柱中的澄清膜，并且 DNA将在PureYield™结合柱中结合到结合膜上。

继续抽吸所有的液体都通过了两个柱。

注意:所有纯化和洗脱步骤均在室温下进⾏。

10. 在进⾏前，从过滤装置中缓慢释放真空。

移除PureYield™清除柱，将PureYield™结合⾊谱柱留在泵上。

注意:如果真空释放得太快，膜可能会从柱上分离。

如结合膜脱落，⽤带⼿套的⼿指或1.0ml⽆菌溶液的⼤端轻轻轻拍移液器尖端，或打开真空，让压⼒重新安置膜。

11. 向柱中加⼊5.0ml的内毒素清除液，让真空泵将溶液穿过。