淋巴细胞分离实验..

人周血淋巴细胞分离液技术要求引言：人周血淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们对于疾病的预防和治疗具有重要意义。

因此，人周血淋巴细胞分离液技术的发展和应用具有重要的临床和科研意义。

本文将从实验设备、试剂和实验操作等方面介绍人周血淋巴细胞分离液技术的要求。

一、实验设备1.高速离心机：用于离心样品，获得血细胞和血浆分离。

2.恒温振荡器：调节培养基的温度和震荡条件，确保细胞的生长和生存条件。

3.显微镜：观察细胞培养的状况，判断细胞的活性和纯度。

4.细胞计数仪：准确计算细胞数目，掌握细胞的生长和增殖情况。

二、试剂2.淋巴细胞分离液：选择合适的分离液，如密度梯度离心法、免疫磁珠分离法等。

分离液应具有高分离效率和良好的细胞生存率。

3.培养基：如RPMI-1640培养基等，含有必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子等，提供细胞所需的养分和生存环境。

4.细胞增殖试剂：如PHA（植物血球凝集素）、IL-2（白细胞介素-2）等，用于促进淋巴细胞的增殖和活化。

5.细胞保存液：含有冻存缓冲剂和细胞保存剂，保证细胞冷冻保存时的细胞活性和纯度。

三、实验操作2.制备分离液：根据所选的细胞分离方法，制备稀释好的分离液，注意消毒操作，避免污染。

3.样品离心：将血样离心分离，获得血浆和血细胞层。

4.加入分离液：将分离液缓慢注入离心管中，加入足量的分离液以确保细胞的分离效果。

5.离心分离：根据分离液的密度和离心速度，进行适当的离心分离操作，获得淋巴细胞层。

6.细胞计数和检测：使用细胞计数仪计数和检测细胞的活性和纯度，根据需求调整细胞浓度。

7.细胞培养：将分离得到的淋巴细胞进行培养，在恒温振荡器中培养细胞，提供养分和生长环境，促进细胞的增殖和活化。

8.细胞保存：将培养得到的淋巴细胞分装到冻存管中，添加细胞保存液，迅速置于液氮中进行冻存，保存好的细胞可供后续实验和应用。

结论：。

刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。

2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。

3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。

4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。

5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。

6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。

7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。

①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。

②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。

细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。

（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。

9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。

（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。

10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。

11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。

２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。

室温水平离心2000转/分钟，30分钟。

３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。

吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。

４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。

方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。

加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。

“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。

2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。

3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。

(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。

6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。

(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。

(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。

（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。

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淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。

淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。

本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。

实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。

注意避免气泡的产生。

2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。

离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。

3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。

轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。

此步骤的目的是去除红细胞和血浆。

4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。

注意避免两种液体混合。

离心管中的液体应该形成明显的两层。

5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。

离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。

6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。

加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。

以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。

7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。

8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。

同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。

结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。

在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。

小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。

3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。

4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。

二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。

2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。

离心。

3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。

4加入1640培养液进行培养。

、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

这是鄂征的《组织培养技术及其在医学研究中的应用》中关于分裂淋巴细胞的方法，可供参考。

1.概述：枸橼酸处理的全血，或加葡聚糖加速沉积去除红细胞的血浆，在Percoll-Paque分层液上分出致密层。

离心后，大多数淋巴细胞会积聚在Ficoll/Metrizoate(Ficoll/甲泛葡胺）和血浆之间。

2.方法：（1）枸橼酸或肝素抗凝血携入操作室或HOOD台面（2）用PBSA按1：1稀释，用9ml加入6mlPercoll-Paque分层液中进行分层，注入容量较大的、而且透明不带盖的离心管中，平衡（3）400×g离心15分钟（4）在不干扰交界面情况下，小心去除血浆/PBSA（5）用注射器或吸管吸出交界面液体（吸时最好用钝圆针头或吸管，而不要用尖的头吸（6）用20ml不含血清培养液稀释（7）从交界面来的稀释细胞悬浮，70g离心10分钟（8）去掉上清，重悬沉积物于2ml不含血清培养液中；如果需要去掉血清中因子，可用20ml无血清培养基反复漂洗、离心2～3次后，最后把沉积悬于2ml 不含血清培养基中（9）取少许细胞样品，台盼蓝染色，细胞计数器检测含有核的细胞数（10）接种入无血清或加血清培养基中培养注解：在第（3）步骤沉降中，淋巴细胞集中在杂有一些血小板和单核细胞的交界面上，可能也有一些粒性白细胞。

如欲获纯淋巴细胞，由于单核和粒性白血病喜欢贴壁，可采用贴壁法进行排除，如向悬液中置入无菌载物玻璃片，过一定时间，这些细胞便可附着其上，抽出玻璃片弃掉；或把悬液注入培养瓶或皿中，在镜下观察，过一定时间（10～30分钟），这些细胞如先贴附，而淋巴细胞尚处在悬浮状态下，把悬液倒入另瓶中即可。

当然也可应用更加复杂的方法如流式细胞仪等分离亦可所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清3.细节：a.淋巴细胞分离液要避光保存b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀d.所有操作都应在无菌环境进行e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本祝您好运了！补充两点:1.淋巴细胞分离液在使用前需从4度冷藏取出室温平衡30min.没有此步操作易导致分离失败.2.全血的抗凝一定要充分,不然就会很难出现漂亮的白膜层.即你的(紧接着是一层稍微混浊的白色大概有2CM)3.离心转数一般为2000转,25min.尝试改进下,应该很容易分离的.。