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从琼脂糖凝胶中快速回收dna片段的新方法一、背景介绍DNA是生物体内的重要遗传物质，其在分子生物学和生物技术中具有重要的应用价值。
然而，从大量样本中快速回收DNA仍然是一个挑战。
传统的DNA回收方法需要多个步骤和复杂的操作，耗时且效率低下。
因此，研究人员不断探索新的DNA回收方法。
二、琼脂糖凝胶中快速回收DNA片段的新方法1. 实验原理该方法基于琼脂糖凝胶电泳原理，通过利用琼脂糖凝胶电泳过程中产生的电场将DNA片段从琼脂糖凝胶中迅速回收。
2. 实验步骤（1）制备琼脂糖凝胶：按照常规方法制备1%琼脂糖凝胶。
（2）电泳：将含有目标DNA片段的样品加入到琼脂糖凝胶槽中进行电泳分离。
根据所需分离大小选择适当的电压和时间。
（3）切割：使用无菌刀片或者PCR管套等工具在琼脂糖凝胶中切割出目标DNA片段。
（4）回收：将切割下来的琼脂糖凝胶块放入1.5mL离心管中，加入适量的蒸馏水或TE缓冲液，温和振荡或高速离心使DNA片段溶解于溶液中。
（5）纯化：使用常规的柱式纯化或者乙醇沉淀等方法对DNA片段进行纯化。
3. 实验注意事项（1）制备琼脂糖凝胶时要注意琼脂糖的浓度和pH值，否则会影响电泳效果。
（2）电泳时要根据所需分离大小选择适当的电压和时间，避免过度分离或未能分离。
（3）切割琼脂糖凝胶时要注意使用无菌工具，并在无菌条件下操作以避免污染。
（4）回收DNA片段时要温和振荡或高速离心使其溶解于溶液中，避免过度振荡或高速离心导致DNA断裂。
三、实验优点该方法操作简单、快速、高效，可以快速回收目标DNA片段。
同时，该方法不需要使用DNA纯化试剂盒等耗材，成本低廉。
四、实验应用该方法可以广泛应用于DNA分离、酶切、PCR扩增等领域。
特别是在样品数量较大、时间紧迫的情况下，该方法具有明显的优势。
五、实验展望目前，该方法仍存在一些局限性，如只适用于琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段回收。
因此，未来需要进一步研究和改进该方法，以扩展其适用范围和提高其效率。
实验七琼脂糖凝胶中DNA片段的回收一．原理从琼脂糖凝胶中回收DNA片段．可得到大小一致的DNA片段。
有多种方法可用于琼脂糖凝胶中DNA片段的回收。
例如低融点琼脂糖法、洗脱法等。
本实验方法是先使凝胶被NaI溶解，然后DNA与玻璃粉结合，再从玻璃粉中洗脱出DNA片段。
二．方法1．在琼脂糖凝胶小电泳分离DNA片段，当DNA片段完全分开后，停止电泳。
2．在长波长紫外灯下观察凝胶，切下含所需的琼脂糖部分。
将胶放人预称重的微离心管中。
3．称含凝胶的离心管重量，每0.1g凝胶加200μl NaI溶液。
4．于50℃温育微离心管，每5min颠倒几次离心管混匀离心管，直到琼脂糖完全融解。
5. 每μg DNA加入5μl玻璃粉悬液。
轻轻颠倒使之混匀，于冰上放置10min，使DNA结合在玻璃粉上。
6．于室温离心5秒，收集结合有DNA的玻璃粉。
7．倒掉上清。
加700μl -20℃预冷的清洗缓冲液，轻轻地抽吸，使玻璃粉重悬浮。
冰上放置5min。
8．重复第6与7步两次，于室温离心10秒，使玻璃粉沉淀下来。
倒掉上清，重复离心，小心除去全部残存液体。
9．加入30～50μ1 TE，轻轻吹打使玻璃粉重悬浮。
于50℃温育10min，将DNA洗脱下来。
10．于室温离心l0秒，使玻璃粉沉淀下来。
将上清转移到另一管中。
小心，不要吸人玻璃粉，因为它可抑制许多酶的活性。
三．试剂1.玻璃粉(1)取30g玻璃粉（Sigma 325目二氧化硅）悬于200ml蒸馏水的烧杯中。
搅拌混匀后，静置9min。
(2)将上清转移到离心管中．于6000⨯g离心10min，沉淀玻璃粉。
(3)倒掉上清，将玻璃粉重悬于50ml 25％硝酸中，室温放置过夜。
(4)于6000⨯g沉淀玻璃，用无菌双蒸水洗涤，沉淀玻璃粉4一6次，直到pH值至中性。
(5)用无菌水重悬沉淀，配成10％的浆液。
(6)将此浆液分装成0.1ml一管．贮存于-70℃。
待用的样品呵贮存于-20℃或4⨯。
2．NaI溶液NaI 90.8gNa2SO3 15gddH2O至 100ml3．乙醇清洗液成分为：100mmol／L NaCIlmmol／L DETA，pH8．O10mmol／L Tris—HLc，pH7.550％乙醇四．说明1．本方法琼脂糖凝胶电泳缓冲液只能使用TAE，回收的DNA片段应在0.8～6kb之中。
从琼脂糖电泳凝胶中回收dna的几种简便方法1、离心法：琼脂糖电泳回收 DNA 的最常用方法是使用离心法。
使用离心法可以有效地将终端的 DNA 从被琼脂糖共析的蛋白质中取出。
离心法能有效地将含有 DNA 的细胞和细胞渣分离开来。
使用离心机将DNA 扣离出来时，要确保转速足够慢，以免 DNA 粘在管壁上造成损失。
2、萃取法：萃取法通常应用于对密集的 DNA 示踪膜，这是因为此时DNA 的分析效果较好。
此外，萃取法还能够有效地将 DNA 从培养液中取出，并将浓缩液回收到原始膜中，以简化磁珠清洗和萃取物的溶解程序。
此外，也可以使用此方法进行 DNA 的脱除。
3、滴管抽提法：滴管抽提法是一种有效的自动化方法，用于回收从示踪膜中抽提出的 DNA。
此方法可以以有效的速度抽提出溶液中的 DNA，而且每次抽提都可以精确控制浓度，以避免 DNA 丢失。
使用滴管抽提法可以将 DNA 加入到 T-tubes 中，再将其冲洗，并将 DNA 从 T-tube中取出来。
4、超声消解：使用超声波可以将 DNA 从细胞渣中有效地冲解出来。
使用超声技术可以快速准确地提取细胞渣样品中的 DNA，而无需消耗大量的时间和钱。
此外，超声波提取技术具有成本低、时间短、提取收率高和简便操作等优点，特别适用于大批量和连续提取的技术。
5、四环素：四环素是一种能够定向处理 DNA 的有机化合物，其能有效地将DNA 从琼脂糖电泳凝胶上取出来，是DNA 的一种有效抽提剂。
四环素可以通过在 DNA 上形成“饼干层”，以形成介质层从而形成稳定的 DNA 呈平稳状态，从而彻底沉淀 DNA 杂质物质。
四环素可以将DNA 与蛋白质、酶、胆固醇等混合物清除，paramers，DNA 核苷酸和其他损害手性的添加剂；此外，它还可以去除其他 DNA 杂质，被证明是一种有效的 DNA 抽提剂。
凝胶中回收DNA汇总DNA回收是实验室中常见的一个步骤，也是许多分子生物学实验的重要环节。
凝胶中回收DNA是一种经典的方法，通过凝胶电泳将目标DNA分离出来，然后从凝胶中提取和回收。
凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术，它利用DNA分子在电场中的迁移速度不同而将其分离出来。
通常，我们将DNA样品与一种被称为琼脂糖的聚合物混合，并将混合物加热到融化状态，然后冷却成为凝胶。
将样品加载到凝胶槽中，然后应用电场。
DNA分子会在电场的影响下向阳极迁移，根据大小不同，分子会在凝胶中形成不同的迁移带。
最后，我们可以用染料或者特殊的显色剂来观察和分析凝胶图谱。
在凝胶电泳中，我们通常有两种选择来分离目标DNA：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
琼脂糖凝胶适用于较大的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶适用于较小的DNA片段。
无论是哪种凝胶，回收目标DNA的步骤都是相似的。
首先，我们需要一个电泳槽和相应的电源，以及所需的凝胶（琼脂糖或聚丙烯酰胺）。
其次，我们需要预先制备一定浓度的DNA标准品作为参照物。
接下来，将DNA样品与加载缓冲液混合，并加热到融化状态。
然后，在凝胶槽中设置一个海绵垫，用浸入缓冲液中并保持湿润。
接下来，将融化的凝胶液倒入电泳槽中，留下足够的空间放置样品。
在凝胶液形成凝胶之前，将一组DNA标准品加载到凝胶中。
将准备好的DNA样品加载到凝胶孔中，然后关闭电泳槽，将电源接通，并选择适当的电压和时间进行电泳。
电泳完成后，可以用染料直接在凝胶上观察DNA的迁移带，或者使用特殊的显色剂将目标DNA显色。
接下来就是回收DNA的步骤了。
首先，将电泳槽和盒子倒置，慢慢将凝胶从槽中取出。
尽量保持凝胶的完整性，避免任何的损坏。
然后，可以用刀片或者专用的凝胶切割器将目标DNA的迁移带切下。
将这些凝胶片放入离心管中。
接下来，可以使用商用的DNA回收试剂盒来提取和纯化DNA。
这些试剂盒通常包含几个步骤，包括凝胶碎片的消化、DNA与试剂的结合、洗涤和最终的DNA溶解。
【精品】从琼脂糖凝胶中回收DNA琼脂糖凝胶是一种常用的生物分子分离纯化技术，它适用于分离分子大小差异较大的DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。
在实验过程中，我们通常需要在琼脂糖凝胶中回收目标分子，接下来将以从琼脂糖凝胶中回收DNA为例，介绍琼脂糖凝胶分离和回收DNA的步骤。
I.琼脂糖凝胶电泳分离DNA1.制备琼脂糖凝胶：准备好琼脂糖粉末、TBE缓冲液或者TAE缓冲液、牛奶桶或者其他可用的模具等材料。
将适量的琼脂粉末与缓冲液混合均匀，然后煮沸并搅拌至完全溶解，待温度降至约60℃时，倒入模具内并加入DNA样品。
注意，样品需与样品量较大的样品间留有一定距离，以便于分离。
2.测量DNA迁移距离：在琼脂糖凝胶分离之后，需要用紫外线紫外检测器对每个DNA带进行测量，以确定其迁移距离。
3.切割琼脂糖凝胶：在确定每个DNA条带的位置之后，需要用刀子或切割器从琼脂糖凝胶上切下每个DNA条带，并收集在小管中备用。
切割时需要注意避免污染、损坏DNA。
1.准备回收DNA的缓冲液：一般来说，在回收琼脂糖凝胶中的DNA时，使用的缓冲液类型包括TE缓冲液、纯水、无菌去离子水等。
2.加入缓冲液并恢复DNA：将切下的琼脂糖凝胶条带投入含有缓冲液的离心管中，并在室温下静置10-15分钟，使得DNA从琼脂糖凝胶带上释放出来。
3.离心：恢复DNA的琼脂糖混合物取出后，需要进行离心处理，以使得DNA沉淀到离心管底部。
离心速度一般为12000ppm，离心时间15min。
4.去除上清：离心完毕之后，将上清取出，只保留离心管底部的沉淀。
上清可以用于其他实验。
5.重悬：加入恰当的缓冲液重悬DNA沉淀，例如TE缓冲液、纯水等。
如果需要，可以用比较温和的方法来提取DNA。
6.测量DNA浓度：用分光光度计或者其他光谱仪器，测量DNA的吸收光谱，从而确定DNA的浓度，以便于后续实验的操作。
以上就是从琼脂糖凝胶中回收DNA的步骤。
整个操作需要尽可能在无菌操作室中进行，以避免污染影响结果。
凝胶中回收DNA汇总DNA回收是生物学和分子生物学中常见的实验步骤之一，它是将DNA从溶液中分离并纯化的过程。
凝胶电泳是DNA回收的常用方法之一，其原理是根据DNA分子大小的不同，将DNA分离出来。
在以下的文章中，我们将探讨凝胶中DNA回收的方法以及相关的技术和注意事项。
首先，凝胶电泳是一种常见且广泛使用的分子生物学技术，它能够将DNA分子根据大小分离开来。
在凝胶电泳实验中，DNA样品被加入到一种称为琼脂糖凝胶的介质中，然后将电流通过凝胶，使得DNA在凝胶中移动。
由于DNA的负电荷，它在电场中向阳极方向移动。
较小的DNA分子移动较快，而较大的DNA分子移动较慢。
在凝胶中的回收DNA的过程中，较小的DNA片段通常被选择性地分离和提取。
这可以通过对凝胶进行切割来实现。
切割凝胶时，可以使用一种专门设计的工具，称为DNA切割刀，或者是使用一把消过毒的利器。
通过切割凝胶，可以选择性地提取所需的DNA片段。
另一种用于回收DNA的方法是凝胶片法。
这种方法适用于从几个不同的样品中回收DNA分子。
在凝胶电泳结束后，可以将凝胶放置在凝胶片上，使其与凝胶接触。
通过将凝胶片压到凝胶上，DNA片段可以通过化学结合的方式转移到凝胶片上。
然后，凝胶片可以使用特殊的染料进行染色，以显示DNA片段的位置。
除了凝胶电泳和凝胶片法之外，还有其他一些方法可用于回收凝胶中的DNA。
其中一种方法是使用商用的DNA回收试剂盒。
这些试剂盒通常包含化学物质和特殊的柱子，可以将DNA选择性地结合在柱子上，然后通过洗涤和洗脱步骤将DNA从柱子中提取出来。
在进行DNA回收时，有一些重要的注意事项需要牢记。
首先，实验操作室和仪器必须保持清洁和无菌状态，以防止外来DNA的污染。
其次，必须使用无菌和消过毒的器具和试剂，以确保DNA样品的纯度和完整性。
此外，处理过程中需要严格遵守个人防护措施，包括佩戴手套和护目镜，以防止接触可能有害的化学物质。
总结起来，凝胶中DNA的回收是生物学和分子生物学实验中常见的步骤之一、它可以通过凝胶电泳、凝胶片法或商用回收试剂盒等方法来实现。
dna 琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收是分子生物学领域中常见的实验技术，它能够有效地提取DNA，是DNA分析的重要一步。
在本文中，我们将详细介绍琼脂糖凝胶回收的整个过程，并提供一些实用的指导。
琼脂糖凝胶回收是一种通过电泳将DNA从琼脂糖凝胶上分离并回收的方法。
首先，在实验开始之前，我们需要制备琼脂糖凝胶，并在其中加入DNA样品。
随后，我们将琼脂糖凝胶与电泳缓冲液一同放置在电泳槽中并施加合适的电压，使DNA样品在琼脂糖凝胶中垂直迁移。
为了使得琼脂糖凝胶回收更加高效，我们需要根据DNA片段的大小调整电泳条件。
一般来说，小分子量的DNA片段迁移速度较快，而大分子量的DNA片段迁移速度较慢。
因此，为了避免DNA片段过度迁移或者导致DNA片段过度聚集，我们需要根据实验需要选择合适的电泳时间和电压。
在DNA片段迁移至所需位置后，我们可以将琼脂糖凝胶从电泳槽中取出。
此时，我们需要注意避免暴露琼脂糖凝胶于紫外线，以免对DNA造成伤害。
在取出琼脂糖凝胶之后，我们需要使用刮胶刀或者专用工具将 DNA 片段从琼脂糖凝胶上切割或刮下。
琼脂糖凝胶回收后的 DNA 片段可以用于各种实验，比如 PCR 扩增、限制性酶切等。
在进行后续实验之前，我们需要将 DNA 片段从琼脂糖凝胶中纯化出来，并去除琼脂糖残留物、电泳缓冲液等杂质。
其中，琼脂糖凝胶纯化技术有多种方法可以选择，例如利用商用纯化试剂盒、硅胶凝胶纯化法等。
总结起来，琼脂糖凝胶回收是一项关键的实验技术，能够高效地提取 DNA 片段。
通过合适的电泳条件和仔细的实验操作，我们可以获得高质量的 DNA样品。
这些 DNA 片段可以被广泛应用于基因克隆、基因组测序等实验中，为我们深入了解生命机制提供了重要的工具。
希望通过本文的介绍，读者们能够更加全面地了解琼脂糖凝胶回收的过程和原理，并在实验操作中获得更好的结果。
琼脂糖凝胶dna回收原理
琼脂糖凝胶DNA回收是一种常用的蛋白质和核酸分离纯化技术，其原理如下：
1. 凝胶电泳：首先，将待回收的DNA样品经过凝胶电泳进行
分离。
在凝胶中，DNA分子根据尺寸和电荷迁移速度的差异
被分离开来。
2. 可视化：然后，用染料（如溴化乙锭）染色凝胶，使DNA
分子在紫外光下能够被可视化。
3. 切取DNA：通过使用灭菌的切割器具（如刮刀或剪刀），
将目标DNA条带切取下来。
注意要避免任何可能的污染。
4. 溶胶化：将切取下的DNA条带放入含有高浓度盐（如氯化
铵或碳酸锂）的洗涤缓冲液中，使DNA溶于溶液中。
5. 沉淀：将洗涤缓冲液中的DNA溶液与等体积的冷乙醇混合，形成DNA沉淀物。
6. 离心：将混合物进行离心，使DNA沉淀下来。
7. 溶解：去除上清液，用无菌蒸馏水洗涤DNA沉淀物，然后
用适当的缓冲液溶解DNA沉淀。
8. 储存：将回收的DNA溶液进行储存，以备后续实验使用。
总之，琼脂糖凝胶DNA回收是通过将目标DNA条带从凝胶中切取下来，然后对其进行溶胶化、沉淀、溶解等操作，最终得到纯化的DNA溶液的过程。
dna片段的胶回收实验思考DNA片段的胶回收实验是一种常用的实验方法，用于分离和提取DNA片段。
在这个实验中，胶回收是指将凝胶中的DNA片段从凝胶中分离出来，并用于后续的实验操作。
DNA是生物体遗传信息的载体，而DNA片段是DNA分子在特定条件下被限制性内切酶切割后得到的特定长度的DNA分子。
在实验室中，研究人员经常需要对DNA进行分离和提取，以便进行进一步的分析和研究。
胶回收实验通常用于凝胶电泳后，需要纯化DNA片段的情况。
凝胶电泳是一种常用的分离DNA片段的方法，通过电场作用，将DNA片段按照其大小分离在凝胶中。
然而，在电泳后，需要将目标DNA片段从凝胶中提取出来，以便进行下一步的实验操作。
胶回收实验的基本步骤如下：1. 准备凝胶：首先，需要制备含有DNA片段的琼脂糖凝胶。
通常，将琼脂糖溶解在缓冲液中，并加热至溶解完全。
然后，将DNA样品与凝胶溶液混合均匀，并倒入电泳槽中，形成凝胶。
2. 进行凝胶电泳：将电泳槽连接至电源，通过施加电场，将DNA 样品在凝胶中进行电泳分离。
根据DNA片段的大小，不同的片段会在凝胶上形成不同的迁移带。
3. 可视化DNA片段：在电泳结束后，需要使用染色剂将凝胶上的DNA片段可视化。
在实验室中常用的染色剂有乙溴化乙锭（EB）或硒化乙锭（SYBR Green）等。
4. 切割目标DNA片段：当目标DNA片段被可视化后，需要使用刮片或者切割器将目标DNA片段从凝胶中切割出来。
切割时应注意避免污染和交叉污染。
5. 胶回收：将切割下来的凝胶块放入离心管中，加入适量的溶剂，如缓冲液或蒸馏水，并将其在恒温摇床上振荡混合，使DNA片段溶解出来。
6. 离心分离：将混合液离心，以分离DNA片段溶液和凝胶残渣。
离心后，DNA片段溶液会位于离心管的上层，凝胶残渣则会位于下层。
7. 提取DNA片段：将上层的DNA片段溶液小心地转移到新的离心管中，丢弃凝胶残渣。
为了保证纯度和浓度，可以使用DNA纯化试剂盒进行进一步的提纯。
琼脂糖凝胶dna回收实验报告1.目的学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的基本技术。
2.原理限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片断。
3.器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。
4.试剂电泳缓冲液，溴化乙锭溶液，电泳级琼脂糖粉，10x加样缓冲液，DNA分子量标准，DNA凝胶回收试剂盒。
5.实验准备配制TAE电泳缓冲液（10x储存液），1000x溴化乙锭储存液（0.5mg/ml)，10x加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；6.操作步骤（1）用1xTAE配制1%琼脂糖凝胶。
DNA用合适的酶切。
（2）在胶上选定加样6孔，加入20ulDNA酶切产物，电泳。
（3）电泳结束后用刀片6切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），EB染色，在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。
（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过得干净的1.5ml 微量离心管中。
（5）按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA酶切产物：使用GENOMED公司提供的Gel Extraction Mini Kit凝胶回收试剂盒，操作步骤如下：1)在紫外灯的照射下，从已电泳15min左右的凝胶上切下目的条带，称得凝胶重量按1：3的比例加入L1溶胶；55-60℃条件下溶胶10min 左右；2)将凝胶已完全溶化的液体移入吸附柱内，室温静置2min，以使DNA片段充分结合到吸附柱上；12,000rpm转速下离心3min，弃废液；3)向吸附柱中加500ulL2，10,000rpm转速下离心1min，以洗掉吸附柱中残留的溶胶液L1，弃废液；4)重复上一步操作；5)12,000rpm离心1min，把吸附柱放入新的EP管中；室温放2-5min，以晾干残留的乙醇；向吸附膜中央滴加30ulddH-O，室温静置2min；6)12.000rpm离心2min，得到DNA片段回收液。
琼脂糖电泳凝胶中回收微量dna片段的新方法
琼脂糖电泳凝胶是分离DNA分子的常用方法，但是在回收微量DNA
片段时存在一定的困难。
近年来，研究人员提出了一种新的方法，可
以有效地回收微量DNA片段。
这种新方法的核心是利用琼脂糖电泳凝胶中的DNA结合染料SYBR Green I。
SYBR Green I是一种荧光染料，可以与DNA结合并发出荧光信号。
研究人员发现，当琼脂糖电泳凝胶中的DNA片段浓度很低时，SYBR Green I会优先结合到DNA片段上，形成SYBR Green I-DNA 复合物。
这种复合物可以通过电泳将其从凝胶中回收出来。
具体操作方法如下：首先，将琼脂糖电泳凝胶切成小块，并加入适量
的SYBR Green I溶液。
然后，将DNA样品加入凝胶中，进行电泳分离。
在电泳结束后，将凝胶切成小块，并用荧光显微镜观察。
可以看到，SYBR Green I-DNA复合物在凝胶中呈现出明显的荧光信号。
最后，将这些荧光信号明显的凝胶块切下来，用适当的方法将其中的DNA片段提取出来。
这种方法具有以下优点：首先，可以回收微量DNA片段，甚至可以回收单个DNA分子。
其次，操作简单，不需要复杂的设备和试剂。
最重要的是，这种方法可以避免传统的DNA回收方法中可能存在的污染和
损失问题。
总之，利用SYBR Green I-DNA复合物回收琼脂糖电泳凝胶中的微量DNA片段是一种简单、高效、可靠的方法。
这种方法可以广泛应用于DNA分子的分离和回收，对于生物学、医学等领域的研究具有重要意义。
碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中DNA的探讨
An Effective Method to Recover DNA from Agarose gel
<<生物技术>>2004年02期
曹阳, 董晓宇, 姜国斌, 乌兰, 安利佳
采用碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中的DNA,达到分离纯化目的,回收后的DNA可用于重组、PCR等研究.首先将含有目的DNA的琼脂糖凝胶用NaI溶液融解,然后加入CaCl2和NaHCO3,生成CaCO3沉淀,DNA与CaCO3形成复合物,通过离心分离出沉淀复合物,利用稀酸溶解沉淀,再用无水乙醇沉降,即可回收目标DNA.利用该方法回收了质粒、毛白杨和转基因羊基因组DNA,回收率为20％～50％,OD260/OD280为1.7～1.9,最大回收了21kb片段,最小回收250bp片段,回收后的DNA样品进行了PCR扩增和限制性内切酶反应,PCR可以扩增出目的片段,同时限制性内切酶可以将回收后的DNA切开,表明DNA质量良好.利用碳酸钙沉淀法可以回收琼脂糖凝胶中的DNA,此法简单、易行,较为有效.
DNA重组实验中的常用技术
点击次数：29 发表于：2008-06-18 14:53转载请注明来自丁香园
来源：互联网
五、真核细胞基因组的制备
从不同组织细胞或血细胞中提取是进行基因诊断的先决条件。
制备的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持分子的完整。
蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。
在提取的反应体系中，SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞膜；（2）解聚细胞中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。
蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使分子尽量完整地分离出来。
具体方法如下：
（一）白细胞的制备
（1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2 灭菌30min）抗凝。
（2）将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl (pH7.5)、5mmol/L MgCl2 、1%Triton –X 100]，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解。
（3）冰浴10min，离心，3000rpm，10min。
弃上清，STMT重复处理1～3次。
（4）弃上清，白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，摇匀，置37℃水浴15～20h。
（5）用等体积饱和酚抽提，3000rpm离心5min。
（6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿-异戊醇（24：1）抽提，3000rpm离心5mi n 。
（7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿-异戊醇（24：1），抽提，3000rpm离心5min。
（8）小心吸取上层水相，加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀，-20℃过夜。
（9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管内，加1ml 75%乙醇4℃静置1h，离心，1 0000rpm 10min。
（10）弃上清，用蜡膜将管口封好，针刺数个小孔，真空抽提（10～15min）。
（11）加200μl 1×TE溶解，置4℃保存。
（12）对所提用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。
（13）取2～4μl 样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提的质量及降解情况。
（二）组织的制备
（1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris, p H7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml带盖的塑料管中。
（2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。
由于从核中释放出来，样品变得粘稠。
（3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37℃保温1～3d，直到组织完全解体。
中间可振动样品管几次。
加0.4ml 5mol/L NaCl。
（4）用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm离心5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。
（5）加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀。
用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段，并移入一新管，吸干中的无水乙醇。
（6）溶于4ml 0.1×SSC中，4℃过夜可作进一步纯化。
（7）加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。
加0.4ml 5mol/L NaCl。
（8）同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。
（9）75%乙醇洗涤2次，离心，弃上清，真空抽干。
适量1×TE溶解，保存在4℃。
六、转移基因
最常用的将克隆重组的片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。
转染的可能是通过吞饮作用进入细胞质，然后进行细胞核。
（1）配制下列溶液
①2×HEPES-缓冲盐溶液（HBS）
②2mol/L CaCl2
③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌，分装贮存于4℃。
④将（约20μg/106 细胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用浓度为40μg/ml。
为使转化效率达到最高，质粒应用CsCl-溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。
如果所用量较少，应加入载体将浓度调至40μg/ml。
实验室制备的真核载体转染效率通常要比商品化的牛胸腺、鲑鱼精高。
载体用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。
（2）转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期的细胞，以1～2×105 细胞/cm2 的密度重新种入60mm组织培养皿中。
在37℃、5%～7%CO2 及一定湿度的培养箱中培养20～24h。
（3）每转染一个60mm培养皿中的单层细胞，须依如下方法制备磷酸钙- 共沉淀物：取步骤一所制备的[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的灭菌5ml塑料管中，缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙（温和混合30s左右）。
于室温育20～30min，其间将形成细小沉淀。
温育结束时，用吸管将混合液吹打一次，使沉淀物悬浮。
通常采用的另一方案是将氯化钙和的稀释混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步骤一制备并溶于氯化钙（250mmol/L）的。
按照前述方法温育之。
如果需要转染更为大量的细胞，上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。
如果体积翻两番，则须使用更大的塑料管，一般在25cm2 细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上，可将0.5ml磷酸钙- 共沉淀物加入5ml培养液中，而在90mm细胞培养皿上，一般将1ml沉淀物加入10ml培养液中。
已经发表的方案中，混合各组分的方式与速率大不相同。
其中有一些认为除了温和振摇之外，其它措施均无济于事，并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。
其它一些方案则规劝在加入溶液时连续而缓慢地混匀，然后再温和振荡。
其目的是为了避免急速形成粗沉淀物，以致降低转化效率。
