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第三章---色谱分析法培训讲学

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色谱分析法原理课件

色谱分析法原理课件

顶替色谱法(置换色谱法)
a
DE
流
DABCD
动 方
向
C
B D+ C
A C+ B
AB
A
顶替剂
b
D
C B
A
顶替色谱法 (置换色谱法)
• 优点:
• （1） 样品量大产率高、被分离样品在分离过程中会自行 浓缩。浓度比洗脱色谱高1—2数量级。柱载高50—100倍
• （2） 可以同时分离样品中的多个组分（与亲和色谱不同） • （3）被分离组分能在相当高的纯度的条件下获得高产率。 • （4）各组分分离界限较清晰，拖尾少，产量和回收率高。 • （5）产品浓度可控 • （6）用小分子顶替剂容易与生物分子分离， • （7）单位柱长固定相利用率高（和用于制备的超载洗脱
V0 =Vm 流动相(非滞留组分)保留值
W1/2 h
保留值
时间/
W
流动相体积
C
A
B
A
两个组分向前 移动的特征
1-1 迎头色谱法
a
ABCD 流
ABC
动 方
向
AB
A
b
A AR AR
ABR
ABR ABR BR
B
a
AB
CD
A
A B
B C
A
b
A
流出体积
1-2置换法(displacement method)
• 又称顶替法，当含三种组分的混合物样品注入色 谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用 一般流动相无法将他们洗脱下来，为此可使用一 种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂 （或称顶替剂）作流动相，当它注入色谱柱后， 可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作 用力的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个 组分的纯品。置换法现已在大规模制备色谱中获 广泛应用，在生物大分子纯品制备中取得良好的 效果

《色谱分析法》PPT课件

《色谱分析法》PPT课件
死时间tm：不被固定相溶解或吸附的组分的保留时 间（即组分在流动相中的所消耗的时间），或流动 相充满柱内空隙体积占据的空间所需要的时间，又 称流动相保留时间
调整保留时间tR’：组分的保留时间与死时间之差值， 即组分在固定相中滞留的时间
tR' tR tm
或t
' R
tR
t0
保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时 所消耗的流动相的体积

16(
t
' R
)2
W
5.54( tR' )2 W1 2
H eff L / neff
讨论：neff 和H eff 扣除了死时间，更能真实的反映柱效 k ，neff n理
小结
塔板理论的贡献：从热力学角度Hale Waihona Puke 提出了评价柱效高低的n和H的计算式
塔板数 n是色谱柱的特征参数。当色谱柱长度一定时，
2. 纵向扩散项（分子扩散项）：B/u
产生原因： 峰在固定相中被流动相推动向前、展开 →两边浓度差
纵向扩散系数 B 2 Dg
— 弯曲因子（ 1） 填充柱 1 空心毛细管柱 1
Dg — 组分在载气中的扩散系数（常数）
影响因素： B u tR ，B Dg
Dg

T

一般分类 液相色谱LC
分离方法
L-L分离
固定相
吸附在固定相表面的液体
液相-固定相 固定相表面键合的有机相
液固或吸附
离子交换
尺寸排阻
气 相 色 谱 GC （流动相为气 体）
气、液 气-键相 气-固定体
超临界流体色 谱 SFC （ 流 动 相超临界流体）
固体 离子交换树脂 聚合物中间隙 吸附在固定相表面的液体 固体表面键合的有机物 固体 固体表面键合的有机物

色谱分析总论PPT资料(正式版)

色谱分析总论PPT资料(正式版)
各种保留值预测理论
２、技术发展
1)超临界流体色谱
❖ 超临界流体：物质处于临界温度和临界压力以上，既不是液 体也不是通常的气体，而是单一相态的流体。
❖ 使用超临界流体作流动相的色谱法称为supercritical fluid chromatography, SFC
❖ 特点：具有气体的低黏度和高扩散系数，又具有液体的强溶 解能力，参与溶质的分配作用，同时具有气相色谱和液相色 谱的优点。
柱长 L u 死时间 t0
调整保留时间(adjusted retention time, tr’ )：某组 份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在 固定相中的滞留时间。即
由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时 间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。
死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管 路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项 可得到：
液体 液体
固体 液体
液-固色谱 液-液色谱
液相色谱LC
气体 气体
固体 液体
气-固色谱 气相色谱GC 气-液色谱
2、按分离的原理分类
❖ 吸附色谱：吸附性能的差异
气固 液固
❖ 分配色谱：分配系数的不同
溶解度 液体
❖ 离子交换色谱：分离组分与固定相离子进行可逆交换
离子交换树脂
❖ 空间排阻色谱：分子筛
Vr' VrV0tr' •Fco
以上保留时间和保留体积又统称保留值。
色谱曲线的意义
✓ 色谱峰数=样品中单组份的最少个数； ✓ 色谱保留值——定性依据； ✓ 色谱峰高或面积——定量依据； ✓ 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； ✓ 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。

《色谱法分析法 》课件

《色谱法分析法 》课件

THANK YOU
汇报人：
色谱法分析法的优 缺点
优点
分离效果好：能够 将复杂混合物中的 组分分离出来
灵敏度高：能够检 测到微量的组分
应用广泛：适用于 各种样品的分析， 包括气体、液体和 固体
自动化程度高：可 以实现自动化操作 ，提高工作效率
缺点
样品处理复杂，需要专业的技术人员进行操作 分析时间长，需要等待较长时间才能得到结果 仪器设备昂贵，需要投入较大的资金进行购买和维护 操作环境要求高，需要保持实验室的洁净和温度稳定
评估指标：分离度、分辨率、 峰形、保留时间等
分离度：衡量两个相邻峰的 分离程度，越高越好
分辨率：衡量色谱图中两个 相邻谱峰的形状， 越尖锐越好
保留时间：衡量物质在色谱 柱中的保留时间，越短越好
色谱法分析法的应 用
在食品分析中的应用
检测食品中的添加 剂和污染物
鉴别食品中的营养 成分和功能成分
分离原理
色谱法分析法是 一种分离混合物 的方法
原理：利用不同物 质在固定相和流动 相中的分配系数不 同，实现分离
色谱法分析法可 以分为气相色谱 法和液相色谱法
气相色谱法适用 于挥发性物质， 液相色谱法适用 于非挥发性物质
检测原理
色谱法分析法是一种分离和检测混合物的方法 原理：利用不同组分在固定相和流动相中的分配系数不同，实现分离 检测方法：通过检测器检测出各组分的信号，进行定性和定量分析 应用：广泛应用于化学、生物、医药等领域
和杂质
生物技术：检 测生物样品中 的蛋白质、核 酸等生物大分
子
法医学：检测 生物样品中的 毒品、毒物等
色谱法分析法的实 验操作
实验前的准备
样品准备：样品处理、样品 稀释等

色谱培训讲议

色谱培训讲议

内标法优点： • 进样量不超量时，重复性及操作条
件对结果无影响 • 只需待测组分和内标物出峰，与其 他组分是否出峰无关 • 适合测定微量组分 内标法缺点： 制样要求高；找合适内标物困难； 已知校正因子
CHO+ + eNO+ + CO + e-
2(O) 石英喷嘴
空气 氢气 （+ 补充气（尾 吹气））
柱出口
当离子被收集极收 集时产生了电流
数据处理系统
色谱数据处理：
C－R6A色谱数据处理机
安捷伦ChemStation 2070BA工作站
安捷伦Cerity NDS QA/QC(石化）工作站 浙大N2010工作站 ATLAS工作站
SSI不分流模式流路图
限流器 进样口压力控制环路 inlet pressure control loop 流量传 感器 比例阀1 压力传感器 隔垫吹扫 调节器 分流流量出口 分流出口 捕集管 分流阀 (关闭/off) 比例阀2
进样过程中分流阀关闭 （没有分流出 口流量） 进样后某指定时间，分流阀打开将剩 余蒸汽吹扫出进样口
色谱过程示意图
分离化合物 气体 , 和
A
B
C
D
色谱柱类型
填充柱
开管柱 (毛细管柱)
将柱长设为0就告诉6890现在安装的是一条填 充柱。
壁涂开管柱(WCOT) 和 多孔层开管柱 (PLOT)
填充柱 柱长 (米) I.D. (mm) .5-10 2-4
530系列柱 5-100 .530
细孔径柱 5-10 .1-.32
30 ml/min 参考气
信号 (+ 极性) = 样品 - 参考气
FID 检测器剖面图

色谱分析法专业知识讲座

色谱分析法专业知识讲座
能够直接从色谱图上计算分离度。
12/30/2023
31
§19—5 定性和定量分析
一、定性分析 色谱定性分析旳任务是拟定色谱图上每一
种峰所代表旳物质。在色谱条件一定时，任 何一种物质都有拟定旳保存时间。所以，在 相同色谱条件下，经过比较已知物和未知物 旳保存值，即可拟定未知物是何种物质。但 是，一般来说，色谱法是分离复杂混合物旳 有效工具，假如将色谱与质谱或其他光谱法 联用，则是目前处理复杂混合物中未知物定 性分析旳最有效旳技术。
12/30/2023
10
§19—2 线性洗脱色谱及有关术语
在洗脱色谱法中，假如将试样注入色谱柱
头，试样本身不久Байду номын сангаас会在固定相和流动相之间
到达分配平衡。当流动相流过时，试样将在流
动相和新旳固定相上又到达分配平衡。同步，
原来仍在固定相中旳试样与新旳流动相之间也
会形成新旳分配平衡。伴随流动相不断旳流过，
它们就会携带发生分配平衡后而存在于流动相
物质作为内标物，然后进行色谱分析，再由被
测物和内标物在色谱图上相应旳峰面积(或峰高) 和相对校正因子，求出某组分旳含量。
(3)调整保存时间t’R 某组分旳保存时间扣 除死时间后称为该组分旳调整保存时间，即
t’R = tR- tM
12/30/2023
17
因为组分在色谱柱中旳保存时间tR包括了 组分随流动相经过柱子所需旳时间和组分 在固定相中滞留所需旳时间，所以t’R实 际上是组分在固定相中停留旳总时间。保 存时间可用时间单位(如s)或距离单位(如cm) 表达。
保存时间是色谱法定性旳基本根据，但
同一组分旳保存时间常受到流动相流速旳
影响，在气相色谱中尤为如此，故色谱工 作者常用保存体积等参数进行定性鉴定。

色谱分析讲义(2020.11.27)


2020/11/28
色谱分析-1 22
分离因子 塔板数 塔板高度
2020/11/28
基本关系式
Байду номын сангаас
'
t V R(2)
2/1
'
t V R(1)
' R(2)
' R (1)
N
16
tR W
2
5.54
tR Wh
2
H L N
N和H都有理论值和有效 值两类,其差别在于用保 留时间和校正保留时间
色谱分析-1 23
基本关系式（死时间测定）
死时间的测定很难：
无合适样品（完全不保留并有足够强的紫外信号）
一般测定方法为（紫外检测器）：
1. 正向——四氟乙烯 反向——苯甲酸、硝酸等
2. 比流动相少一个C的同系物
3. 不具备条件时可用下式计算
空管柱体积 柱总空隙度
tM
流动相体积流量
tM tR2
(tR2 tR1) tR3 tR1 tR3 tR2 tR2 tR1
生素）
2020/11/28
色谱分析-1 7
化学研究
➢ 样品提纯—如合成产品的检验等
➢ 物质性质与其配比的相关性——色 谱法和化学计量学方法结合
2020/11/28
色谱分析-1 8
生命科学研究
➢ DNA测序—用CE、HPLC技术、 ➢ 生物工程下游技术—细胞的培养、分离、纯
化和分析检测
参见 刘国诠主编 《生物工程下游技术》 化学工业出 版社，1993年
GC-MS LC-MS GC-MS-MS GC-FTIR
2020/11/28
色谱分析-1 17
色谱基本理论

《色谱分析基础 》课件

缺点
分离效果相对较差，灵敏度较低。
04 色谱分析实验技术
实验设计
实验目的
明确实验的目标和意义，确保实验具有 实际应用价值。
实验步骤
详细列出实验操作步骤，包括样品处 理、色谱柱选择、进样、洗脱等，确
保实验过程规范、准确。
实验原理
阐述色谱分析的基本原理和实验操作 流程，确保实验的合理性和科学性。
实验安全
数据处理与分析
数据采集
记录实验过程中的各项数据，包 括色谱图、峰高、峰面积等，确 保数据的完整性和准确性。
数据处理
采用适当的数学方法对原始数据 进行处理，如平滑、基线校正、 归一化等，以提高数据的可靠性 和可比性。
结果分析
根据处理后的数据，进行结果分 析和解释，得出实验结论，为实 际应用提供科学依据。
优点
分离效果好、分析速度快、灵 敏度高。
缺点
对于高分子量和热稳定性差的 化合物不太适用。
液相色谱法
原理
利用液体作为流动相，将样品中的各 组分在固定相和流动相之间进行分离 ，再通过检测器进行检测。
应用范围
主要用于分析高分子量、热稳定性差 、不易挥发的有机化合物，如蛋白质 、核酸等生物大分子。
优点
分离效果好、分析速度快、灵敏度高 ，适用于复杂样品的分析。
色谱分析具有高效、高分辨率和高灵敏度等特点，广泛应用于化学、生物、医学 和环境等领域。
色谱分析的原理
分离原理
色谱分析基于不同组分在两相之间的吸附或溶解性能差异进行分离。在流动相 的带动下，各组分在固定相和流动相之间反复分配，最终达到分离。
检测原理
通过检测器对分离后的组分进行检测，将组分的浓度或质量转化为电信号，以 便进行定量和定性分析。常见的检测器有紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、质谱 等。

色谱分析课件

用GF254板 -------显色剂显色,破坏性检出方法
通用显色剂
定性分析
1. 与标准对照品在三种不同的展开剂中展开 (加熔点)；
2. 制备TLC，将待定性化合物分离后，刮下、 洗脱，再波谱分析；
3. TLC与其它技术联用
定量分析
1. 间接定量（洗脱测定法）； 2. 直接定量（薄层扫描法）
薄层扫描法：以一定波长的光照射展开后 的薄层色谱板上被分离组分的斑点，测定 斑点对光的吸收强度或所发出的荧光强度， 进行定量分析的方法。 薄层吸收扫描法 薄层荧光扫描法
色谱法的特点
（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。
（2） 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。
（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
GC的特点
1. 分离效率高（填充柱上千块塔板；开管柱 106块塔板）
2. 分析速度快 3. 样品用量少（检测限低，高灵敏检测器） 4. 缺点：（约20%样品适用） A. 样品须能气化（350度下有一定的挥发性） B. 热稳定性要好 C. 定性困难
第二节 气相色谱术语、理论
1. 气相色谱流出曲线 2. 分配系数与容量因子 3. 塔板理论 4. 速率理论 5. 分离度 6. 基本分离方程
• 添加剂
荧光指示剂
硝酸银溶液
制板、活化
点样
1.溶剂对样品的溶解度适中； 2.溶剂沸点适中； 3.样品浓度适中； 4.原点位置应在展开剂液面上； 5.定性分析:内径0.5mm管口平整的毛细管

色谱分析仪培训教材

一一、、 色色谱谱法法的的特特点点、、分分类类1.概述 俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。

固定相试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。

其中的一相固定不动，称为固定相；流动相另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。

什什么么是是色色谱谱法法？？当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。

由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。

与适当的柱后检 测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础2.色谱法分类(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。

按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。

按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。

离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH 值的水溶液为流动相。

(3)其他色谱方法 凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。

超临界色谱： CO 2流动相。

二、高效液相色谱仪（HPLC ）1. 液相色谱的检测器高效液相色谱仪主要由泵、分析柱、柱温箱、检测器、计算机几部分组成1.1紫外—可见光检测器的工作原理：紫外—可见光检测器是通过测定样品在检测池中吸收紫外—可见光的大小来确定样品含量的，当一束单色光辐射通过物质溶液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。

1.2示差折光检测器工作原理：任意一束光由一种介质射入另一种介质时，由于两种介质的折射率不同而发生折射现象，示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的。

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基线漂移：指基线随时间定向地缓慢变化。 （仪器不稳定造成的）
第四节 基本术语
基线噪声：指由各种因素所引起的基线起伏。 （仪器本身所固有的，以噪音带表 示，仪器越好，噪音越小）
第四节 基本术语
3、色谱峰高-色谱峰顶点与基线之间垂直距离(h)
第四节 基本术语
❖4、色谱峰区域宽度
区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函 数，用以衡量色谱柱的分离效能，通常区域宽 度越窄越好，度量色谱峰区域宽度通常有三种 常用参数。
色谱法是利用不同的物质具有不同的K值而 进行分离的。
第四节 基本术语
1、色谱图和色谱峰
流动相
被分离组分 固定相
第四节 基本术语
色谱图： 试样中各组分经色谱柱分离后，随流
动相依次进入检测器，将各组分浓度变化 转为电信号，在记录仪上记录为检测器响 应信号随时间变化的曲线，即色谱流出曲 线。
第四节 基本术语
第三节 色谱分离的基本原理
❖思考：
试样中的各组分具有不同的 K 值是分离的基 础，如果两种组分 K 值完全相同，能否分离？怎 么办？
每个组份在各种固定相上的分配系数 K 是不同的，当两种组分在某一固定相中无法 分离时，改用其它适宜的固定相可改善分离 效果。
第三节 色谱分离的基本原理
❖当两相作相对运动时，试样中的各组分就在两相 中进行反复多次的分配，使得原来分配系数只有 微小差异的各组分产生很大的分离效果，即实现 差速迁移，达到分离的目的。所以，可以认为：
❖色谱峰：色谱柱流出组分流经检测器时，检 测器对其响应信号随时间变化所形成的峰形 曲线。
高 斯 分 布！
第四节 基本术语
2、基线 柱中仅有流动相（无试样）通过时，
检测器响应讯号的记录值即为基线。 基线反映了在实验操作条件下，检测
系统噪声随时间变化的情况。稳定的基线 应该是一条水平直线。
第四节 基本术语
1931年，德国的库恩——60余种胡萝卜素的分离 ——1938年诺贝尔化学奖；
1948/1952年诺贝尔化学奖——英国的马丁和辛 格；
1949年，Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂 ——薄层板——薄层色谱法（TLC）推广和应用；
1965年，Giddings将色谱理论继续完善，为日 后的色谱发展奠定了理论基础；
组分在固定相和流动相两相 间发生的吸附和解吸附、溶解和 挥发的过程，叫做分配过程。
在一定温度和压力下，组分 在两相间分配达到平衡时的浓度 比，称为 质在 在流 固动 定相 相中 中的 的浓 浓 C度 度 Cms
某组分的 K = 0时 组分的分配系数 K 越大，代表组分与固定相
作用力越强，越倾向于保留在固定相中。
混合物中不同组分具有不同的分配系数K， 是实现混合物中各组分分离的基础。
第三节 色谱分离的基本原理
❖思考： 在相同固定相条件下，具有不同分配
系数 K 值的组分是按照什么顺序先后出峰 的？
按分配系数 K 的大小先后出峰：分配 系数 K 小的组分在色谱柱中保留时间短， 先出峰；分配系数 K 大的组分在色谱柱中 保留时间长，后出峰！
第二节 色谱分离过程及定义
❖1、 色谱法定义 ➢色谱法（chromatography）/色层法/层析法
①是一种物理化学分析方法；
②它利用混合物中各物质在两相间分配系数 的差别；
③当溶质在两相间做相对移动时，各物质在 两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。
第二节 色谱分离过程及定义
❖2、 基本概念
…… ……
第一节 概述
❖3、色谱法在药物分析中的地位和作用 分析对象多为混合物——分析鉴定组分和含
量——必须进行分离——色谱法高超的分离能 力（显著特点）——色谱法成为多种分析方法 的先决条件和必需步骤
第一节 概述
❖表：中国药典中色谱法的应用
第一节 概述
➢ 中国药典一、二部所收录药物中，80%以上的鉴别、 检查或测定采用色谱法。
第二节 色谱分离过程及定义
A组分: 走过一个颗粒1s;则十个10s,
一百个100s,一万个10000s ……
B组分: 走过一个颗粒1.1s;则十个11s,
一百个110s,一万个11000s ……
差异增大——分离！
第三节 色谱分离的基本原理
当流动相携带混合物流经固定相时，混合物中各 组分与固定相发生相互作用。
第四节 基本术语
标准偏差()：即0.607
倍峰高处色谱峰宽度的 一半。
半峰宽(W1/2)：色谱峰 高一半处的宽度 W1/2 =
2.354。
峰底宽(WB)：4。色谱
峰两侧的转折点所作切 线在基线上的截距。
第四节 基本术语
相
液
液
液体
相 色
相 色
谱
谱
仪
第二节 色谱分离过程及定义
❖高效液相、气相色谱仪
第二节 色谱分离过程及定义
❖4、 分离过程
色谱法分离要素:
➢ 两相(流动相和固定相) ➢ 样品各组分在两相中分配的差异
两要素!
王府井 (色谱柱)
第二节 色谱分离过程及定义
组分间结构,性质差异 与固定相作用差异
随流动相移动速度不等 差速迁移 色谱分离
三概念!
流动相
色谱柱
固定相
第二节 色谱分离过程及定义
❖固定相：填入柱内静止不动的一相 （分离介质）
❖色谱柱：装有固定相的柱子 （分离容器）
❖流动相：自上而下运动的一相 （运载体——携待分离组分进入 色谱柱实现分离）
第二节 色谱分离过程及定义
❖3、 色谱法分类
气体 流 动 超临界
气 相 色 谱
气 相 色 谱 仪
由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相之 间产生的作用力的大小、强弱不同，使得各组分 被固定相保留的时间不同，随着流动相的移动， 各种组分按一定次序由固定相中先后流出。
与适当的柱后检测方法结合，即可实现混合物中 各组分的分离与检测。
第三节 色谱分离的基本原理
❖分配系数K
如何衡量组分与固定相相互作用力的大小？
第三章---色谱分析法
第一节 概述
❖ 1、起源 1903年，俄国植物学家茨维特Tsweet 植物色素分离实验
色：颜色 谱：图谱
第一节 概述
❖茨维特植物色素分离实验
植物提取液 CaCO3玻璃柱 石油醚淋洗
第一节 概述
实 验 过 程
第一节 概述
❖2、发展
1906年，茨维特发表论文——首次提出应用吸附 原理分离植物色素的新方法——命名“色谱法”；