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人成骨细胞原代培养1.人成骨细胞的分离和培养：在无菌条件下取自体骨移植患者少量的松质骨，装入无菌HANK’S液中，迅速运送至实验室，充分剥离骨膜及软组织，把将骨块置于盛有DMEM培养液的培养皿中修整为1mm×1mm×1mm大小的碎块，将松质骨块置入含有2∼3mlPBS的EP管中，用力摇动数次，然后静止30秒，令骨块沉下，小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液，无菌PBS冲洗3次。
在松质骨块粒内加入红细胞裂解液(碳酸氢钠840mg、乙二胺四乙酸37.2mg、氯化铵8.023g、双蒸水1000mL，pH为7.2)，体积比为1∶2，裂解8min，离心去上液，至骨片发白放入离心管内。
2.酶消化法：加入10倍的2.5g/L胰蛋白酶，在37℃恒温箱振荡预消化20min，胎牛血清终止消化，弃去消化液，PBS清洗两遍。
再加入体积比为1∶8的0.1%的Ⅰ型胶原酶密封置于37℃水浴箱内振荡消化1h，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤后再1000r/min离心5min，沉淀用DMEM-F12完全培养液重新悬浮反复吹打均匀，将细胞悬液通过200目不锈钢筛网，去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分，保留骨粒。
剩余骨粒重复Ⅰ型胶原酶消化，共3次。
然后将3次消化所得的细胞悬液用血球计数板计数，制成5×107L-1的细胞浓度(台盘蓝染色显示存活的细胞不少于95%)，接种于无菌培养皿中，在体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37℃条件下培养。
48h后换液，弃去悬浮细胞，每隔2d换液1次，细胞接近融合时传代。
3.组织块法：将消化过的骨块，先用血清润湿，然后用吸管均匀接种至25 cm2的培养瓶中，翻转培养瓶，小心加入5 mL DMEM-F12完全培养液后，放入体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养4 h后小心翻瓶。
每周换液1次，第3周起每周换液2次，细胞接近融合时按1∶ 2传代。
原代细胞克隆形成实验原理一、引言原代细胞克隆是指通过将原代细胞分离并培养，使其形成与原代细胞相同的克隆细胞群体。
这种技术被广泛应用于生物医学研究、生物工程和农业领域，对于细胞的功能研究、药物筛选和基因改造具有重要意义。
本文将介绍原代细胞克隆形成实验的原理和步骤。
二、原代细胞克隆形成实验原理原代细胞克隆形成实验主要基于细胞的增殖特性和分化能力。
细胞增殖是细胞生命周期中的一个重要过程，通过细胞分裂可以产生两个或更多的细胞。
分化是指细胞在特定条件下转变为特定类型的细胞。
在细胞克隆实验中，我们利用细胞的增殖特性和分化能力，将原代细胞分离并培养，使其形成克隆细胞群体。
三、原代细胞分离原代细胞分离是实现细胞克隆的第一步。
通常，我们从动物或植物组织中取得原代细胞，例如从小鼠胚胎中获取胚胎成纤维细胞。
然后，利用消化酶或机械方法将组织分解成单个细胞。
分离后的细胞可通过显微镜观察验证。
四、原代细胞培养原代细胞分离后，需要将其培养在适当的培养基中，提供细胞所需的养分和环境条件。
培养基的选择对于细胞的生长和分化至关重要。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640和MEM等。
此外，培养基中还需要添加血清和抗生素等物质，以促进细胞的增殖和防止细菌污染。
五、细胞增殖和分化原代细胞在培养基中经历细胞增殖和分化的过程。
细胞增殖是指细胞通过分裂产生新的细胞，从而形成细胞群体。
细胞分化是指细胞根据特定的信号和环境条件转变为特定类型的细胞，具有特定的功能和形态。
在培养过程中，细胞会不断增殖和分化，形成克隆细胞群体。
六、细胞筛选和传代在细胞克隆形成实验中，为了获取具有相同遗传特性的细胞群体，需要对细胞进行筛选。
常见的筛选方法包括荧光染色和细胞表面标记等。
筛选后的细胞可以进行传代，即将细胞分离并继续培养。
传代可以使细胞持续增殖和分化，保持克隆细胞的稳定性和纯度。
七、应用领域和前景原代细胞克隆形成实验在生物医学研究、生物工程和农业领域有着广泛的应用。
人成纤维细胞的原代培养方法及步骤
材料准备
成纤维细胞
人成纤维细胞完全培养基
实验步骤
水浴锅37℃预热。
完全培养基温浴到37℃。
在15mL离心管中加入5mL以上完全培养基备用。
从-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。
注意融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化迅速、均匀；且晃动时应避免水没过管盖造成污染；管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，即停止水浴。
继续晃动冻存管，至冰晶融化。
用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。
在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的离心管中。
用1mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞，减少损失。
细胞悬液以250×g，离心4min。
离心后去除上清。
加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
将细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。
加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。
摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。
注意接种2h内不可移动、观察细胞。
这会严重影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。
复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。
之后，每2天更换一次完全培养基，直到细胞生长至90%汇合，即需传代。
通常用人成纤维细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。
请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
一、概述原代细胞是从组织或器官中分离得到的未经过传代培养的细胞，通常被用于研究细胞的特性和生物学行为。
在细胞生物学研究中，原代细胞的分离、培养及鉴定是非常重要的步骤，它们可以为科学家提供更加真实的细胞生理功能和反应。
本文将讨论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定方法。
二、原代滋养层细胞的分离1. 准备工作在进行原代滋养层细胞的分离前，先准备必要的材料和试剂，包括消毒器械、胰酶、培养基和培养皿等。
2. 组织样本的处理将所需的组织样本取出并进行消毒处理，然后用无菌工具将其切割成小块。
3. 酶解和分离将组织样本块放入含有适量胰酶的培养基中，进行酶解和振荡分离，以获得细胞悬浮液。
4. 细胞分离通过离心等方法，将细胞悬浮液离心沉淀，然后将上清液中的细胞转移到新的培养皿中。
三、原代滋养层细胞的培养1. 培养基的准备根据原代滋养层细胞的类型和特性，选择适当的培养基，并添加相应的生长因子和营养成分。
2. 细胞的培养条件将分离得到的原代滋养层细胞接种于含有培养基的培养皿中，放置在恒温培养箱内，保持适当的温度和湿度条件，定期更换培养基。
3. 细胞的观察和维护利用显微镜观察细胞的生长情况和形态特征，定期对细胞进行传代培养，确保细胞的健康和稳定生长。
四、原代滋养层细胞的鉴定1. 形态学鉴定采用显微镜观察细胞的形态特征，包括大小、形状、胞浆及核的结构等，与已知的细胞形态进行比对鉴定。
2. 免疫细胞化学鉴定利用免疫细胞化学染色技术，检测细胞内特定蛋白的表达情况，例如细胞信号分子或细胞骨架蛋白等，来确定细胞的类型和特性。
3. 分子生物学鉴定通过PCR、Western blot等分子生物学技术，检测细胞内特定基因的表达情况，以确定细胞的遗传特性和分子水平特征。
五、结论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定是细胞生物学研究中的重要环节，操作规范和技术熟练对于获得高质量的原代细胞至关重要。
只有通过严格的分离和培养条件，并结合形态学、免疫细胞化学及分子生物学鉴定等手段，才能得到真实、可靠的实验结果，并为细胞生物学研究提供可靠的资料。
人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性王晓华，王扬，蒋涛，付立业，姜又红（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001）摘要：目的探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法，为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据。
方法胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞；细胞生长曲线及MTT 法测定细胞增殖能力；流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数；倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态；HE 染色观察细胞爬片下的形态及着色；免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白；电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构。
结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞；传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强；倒置镜下观察、HE 染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞。
结论本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养。
关键词：人；皮肤；原代培养；成纤维细胞；细胞增殖指数；细胞形态学中图分类号：R318.08文献标志码：A文章编号：0258-4646（2010）12-1041-04Primary Culture and Biological Characteristics of Human Skin Fibroblasts 随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，这些现象都与成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常有关［1］。
人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一［2］。
它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力［3］，从而修复老化的皮肤。
成纤维细胞是维持皮肤弹性和韧性的重要细胞［4］，因其特有的生物学特性，在抗皮肤衰老中起着重要的作用。
本研究拟通过皮肤成纤维细胞的分离和体外培养，观察、总结体外培养的成纤维细胞生物学特性，在细胞水平上对皮肤成纤维细胞的形态及生物学特性进行研究，以获得在体外稳定生长的皮肤成纤维细胞，为成纤维细胞在医学美容除皱术中的应用提供可靠的科学依据［5］。
人肺的成纤维细胞1.准备2个50ml的离心管，加入20ml的1640+10%FBS+0.1%三抗。
置于冰盒内。
手术标本取距离肿瘤2cm的标记CAF；距离肿瘤大于2cm的标记NF。
取回的组织在超净台内处理。
2.用1%双抗PBS清洗组织，直至溶液清洗。
尽量去除血清及杂志。
去除血管（黑）等附属物。
3.用剪刀剪碎组织（时间5min以内），大小1mm3,加入双抗PBS,将组织吹散，静止15min,更换新的PBS，离心沉淀组织块。
4.用FBS打湿25cm2培养瓶底，吸掉多余的FBS，静置。
准备200ul 的tip剪掉尖头，用火烧弯。
200ul的tip吸取组织快，接种于培养瓶内，每瓶大约25块。
将培养瓶倒置，加入2ml的1640+10%FBS+0.1%三抗，置于培养箱中，6.除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。
注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。
7.传代用0.25%胰酶常规消化，以1:2传代，传代完后，采用差速贴壁法纯化一次，即待细胞贴壁1.0 –1.5 h后(即绝大多数成纤维细胞都已经贴壁)，弃去未贴壁的细胞和培养液，更换新的培养液。
鼠成纤维细胞的原代培养1.小鼠颈椎脱臼致死,置于75%的酒精中,转移到超净台内.2.酒精擦拭小鼠2次.镊子夹取皮肤,剪开笑口,钝性分离.剪开肿瘤块外包膜(NF)一个小口,剥离出肿瘤块放入一个培养皿中.剪掉外包膜,放入另一个培养皿中（NF）.洗涤两次.封口转移至细胞放内.3.NF培基吸走,用剪刀剪碎至0.5-1mm3CAF剪取肿瘤块的内包膜，剪碎至0.5-1mm3Ⅳ型胶原蛋白（或胰酶），4℃（或37℃）培养箱过夜。
（或者此步骤省掉）。
4.用纯的血清或者20%血清浸湿组织块。
弯头吸管（注射器）吸取组织块，培养瓶种植0.5CM间隔，15-20块/25ML培养瓶。
5.将组织块加到培养瓶壁上，竖起，培养箱中培养2-4h，直至贴壁。
加入培养基培养。
翻动培养瓶使底朝上，加入2-3ML的培养基，塞紧瓶塞，置于培养箱，2-3h,待组织贴壁。
•实验研究•原代人眼Tenon's囊成纤维细胞的生物学特性及体外培养方案优化王丽君李宏松张文怡廖丁莹杨熹婷王建明【摘要】目的优化原代人Tenon's囊成纤维细胞(HTFs)体外分离、培养的实验方法，并对体外培养的HTFs的生长特性进行观察。
方法采用优化的组织块贴壁法培养原代HTFs；倒置显微镜观察HTFs的基本形态特征；免疫荧光染色Vimentin及CyWbeotin对所培养的原代细胞进行鉴定;采用噻唑蓝比色试验检测细胞增殖活性及生长曲线;流式细胞术检测细胞周期及增值指数。
结果组织块贴壁后9~7d可以见长梭形细胞长出3~3周后可传代。
细胞生长曲线近似“S”形,MTT法显示在第3~5d细胞增殖能力显著。
免疫荧光染色Vwentm阳性率达98% ,CyWbeotin阴性，符合HTFs特性且无上皮细胞污染。
第3~9代HTFs中(63,43士12,26)%处于G2/G)期，(14.80+5.07)%处于G2/M期，(24.34土427)%处于S期，HTFs的增殖指数为35.0%,细胞增殖良好。
结论建立了一种简单、经济、有效的获取原代人Tenon'囊成纤维细胞的方法,为研究青光眼滤过泡瘢痕化提供了可靠的靶细胞模型。
【关键词】原代成纤维细胞;Tenon'囊;原代培养[临床眼科杂志,2020,23:551] Biologicci charocteristicc of primary human TeconS ccpsuic UOroblastc and optimization of thc cUthi'e proto-CoU in vitro Wang LLun,Lt Hongsoog,Zhang Weeut,Lao Dingyrnj,lag Xiting,Wang Jianming.Department of Oph-maOnolofu u T'he Secood ffifiLated Hosphai of Xian Jiaotong UnLersip,Xiaa712004,China【Abstrocti Objective To optimize the expeCmental method of isolation and culture of primao humax Tenons capsule fibwbmsW(HTFs)i n vitro,and observe the growth characteristics of HTFs.Methodt Primag HTFs were culturedbp the optimized adherent methob.Morphological chaocteCstics of the HTFs wew obsewed bp inverted microscope and the HTFs were identifies by Vimentin and CyWberatin immunoVuowscence staining.Thc cell proliferation activity and growth curve were measured by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay,and cell cyclo and proliferation index were measured by Oow cytometry.Results Thc Cng syindlo cells could be seen after9-7daps of the tissues attachment to the peWi dish,and passaged after6〜3weeds.Thc cell growth curve ayproximawd the"S"shape,and the cell prohferation abiUty was remarPablo at3-5daps after the cell passaye.Thc positive rate of Vimentin immunoVpowscence staining was98%and that of CyWberatin immunoOpowscence staining was neqative,which was consistent with the chaocteCstics of HTFs withoxt eyithePai cell contamination.Thc results of Oow cytometp showed that in the3-40generation of HTFs,(63.48土14.06)%cells were in G2/G)phase,(14.32±5.07)%cells were in G6/M phase,ad(22.34±4.07)%cells were inS phase.Thc prohferation inUex of HTFs was35.6%,representing well cell prohferation.Conclusions A simple,economical and ePective for cultuCng and obtaining HTFs was estabUshed,which prevideS a rePablo expeCmental cytologicai model for the basic research of Oltering bled scar after gmucoma filtration.【Key woolsi Primary fibrobmsW;Tenons capsule;PCmarg culture[J CUn Ophthalmoi,2222,23：581]青光眼是常见的不可逆致盲性眼病，滤过手术是抗青光眼的主流治疗方法，但术6年的失败率高达10%~36%[-],研究显示Tenon's囊成纤维细胞(humud Tesou fibwbCsts,HTFs)的增殖、迁移以及纤维化在滤过泡瘢痕化过程中发挥着重要作用[23]。
人原代支气管上皮细胞的简易分离和培养谢冬;翟成凯;刘影影;赵乐;张彬彬;吴卫东【摘要】目的建立一种实验环境更贴合人体、方便快捷、细胞活性和纯度较高的支气管上皮细胞原代培养方法.方法通过纤维支气管镜刷检获取新乡市第一人民医院收治的63例患者正常的支气管上皮细胞,采用无血清的支气管上皮细胞培养基(BEGM)进行纯化、分离,行原代培养并传代,锥虫蓝染色,光学显微镜下观察细胞存活状态并测定细胞存活率,通过倒置生物式显微镜和免疫组织化学染色观察鉴定细胞.结果人支气管上皮细胞的平均存活率为(96.8±0.5)％,细胞免疫荧光角蛋白染色阳性,兔抗人细胞角蛋白8单克隆抗体免疫组织化学染色显示细胞质着色为绿色,细胞核复染为蓝色,鉴定为人原代支气管上皮细胞.结论经纤维支气管镜刷检获取并采用无血清BEGM培养人原代支气管上皮细胞操作简便、快捷有效,细胞存活率较高,能够提高上皮细胞纯度,可以为研究呼吸系统疾病提供良好的模型.【期刊名称】《新乡医学院学报》【年(卷),期】2018(035)010【总页数】5页(P854-857,864)【关键词】人支气管上皮细胞;原代培养;鉴定【作者】谢冬;翟成凯;刘影影;赵乐;张彬彬;吴卫东【作者单位】新乡医学院公共卫生学院,河南新乡453003;新乡医学院公共卫生学院,河南新乡453003;新乡医学院附属新乡市第一人民医院呼吸科,河南新乡453000;新乡医学院附属新乡市第一人民医院呼吸科,河南新乡453000;新乡医学院附属新乡市第一人民医院呼吸科,河南新乡453000;新乡医学院公共卫生学院,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】Q813.1支气管上皮细胞是呼吸道黏膜的第1道屏障，在抵御病原体、异物入侵和机械损伤的过程中发挥重要的免疫调控作用[1]。
支气管上皮细胞与呼吸系统疾病关系密切，通过损伤后的异常修复，分泌多种炎性介质和细胞因子，参与疾病发生、发展的不同环节[2]。
