微生物发酵法生产L-色氨酸的研究
摘要：L-色氨酸是人体和动物体生命活动必需的8种氨基酸之一，在人体内不
能自然合成，必需从食物中摄取。它以游离态或结合态存在于生物体中，对动物的生长发育、新陈代谢等生理活动起着非常重要的作用，被称为第二必需氨基酸，在食品、饲料和医疗等诸多行业应用广泛。L-色氨酸的生产方法有化学合成法、转化法和微生物发酵法。近年来，随着代谢工程在色氨酸菌种选育中的成功运用，微生物发酵法逐渐成为主要的色氨酸生产方法。系统综述了微生物发酵法生产色氨酸所涉及的代谢工程策略，包括生物合成色氨酸的代谢调控机制以及途径改造的措施和效果，此外，还探讨了 L-色氨酸未来的发展前景。
关键词：L-色氨酸；代谢工程；微生物发酵法
1 L-色氨酸的理化性质〔1～3〕
L-色氨酸学名为B-吲哚基丙氨酸,英文名L-Tryptophan,化学名L-B-(3-吲哚基)-A-丙氨酸,别名L-胰化蛋白氨基酸,化学式C11H12O2N2,相对分子量204.23。L-色氨酸属于中性芳香族氨基酸,呈白色或微黄色结晶或结晶粉末,无臭,味微苦。L-色氨酸在水中微溶,在乙醇中极微溶解,在氯仿中不溶,在甲酸中易溶,在氢氧化钠试液或稀盐酸中溶解,在酸液和碱液中较为稳定,但在存在其他氨基酸或糖类物质时则易分解。L-色氨酸有3种光学异构体,长时间光照易变色。L-色氨酸在水中加热产生少量吲哚,在与氢氧化钠或硫酸铜共热时则产生多量吲哚。
图1-1 L-Trp的分子结构
Fig.1-1 The molecular structure of L-TRP
2 L-色氨酸的用途
L-色氨酸在生物体内不能自然合成，需要从食物中摄取，是动物和一些真菌生命活动中的必须氨基酸。L-色氨酸在蛋白质中含量很低，平均含量约1%或更少[4]。L-色氨酸能调节蛋白质的合成、调节免疫及消化功能[5]、增加5-羟色胺代谢作用
以及增强认知能力[6]等，因此在人和动物的新陈代谢、生长发育中有重要作用。L-色氨酸的这些营养和药用价值使其被广泛应用于医药、饲料和食品等行业。
3 L-色氨酸的合成方法
L-色氨酸的生产方法有化学合成法、转化法和微生物发酵法。化学合成法由于存在工艺复杂、产品成分复杂等原因，已逐渐被淘汰。而转化法( 酶转化法和微生物转化法) 虽然已经实现了工业化，但仍然存在原料昂贵、低转化率等问题。以葡萄糖等廉价原料来生产色氨酸的微生物发酵法是最早开发的色氨酸生产方式，但这种方法在很长的一段时期内都无法实现工业化。究其原因，主要是在早期的研究中，研究者单一依靠传统的化学或物理诱变方式选育色氨酸生产菌株; 但是色氨酸的生物合成途径存在极其复杂的调控机制，仅通过诱变方式无法根除其所有的代谢调控作用，因此在这种情况下，研究者无法获得优良的菌株用于 L-色氨酸生产。近年来，随着 DNA 重组技术的快速发展，特别是代谢工程育种方式的兴起，研究者逐渐选育出一批高产的色氨酸生产菌株，大幅提高了微生物发酵法生产色氨酸的效率，使其成为工业上主要的色氨酸生产方法〔7〕。本文系统综述了微生物发酵法生产L-色氨酸所涉及的代谢工程策略，并探讨了其未来的发展趋势。
4 L-色氨酸的微生物合成机制
4.1 微生物合成L-色氨酸的代谢途径
目前用于生产 L-Trp 的微生物种类主要有大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、枯草杆菌、酵母等菌种。各种微生物的 L-Trp 合成机制略有差异，以大肠杆菌为例，L-Trp 合成代谢包括中心代谢途径、芳香族氨基酸共同途径和L-Trp 分支途径三个部分[8]。中心代谢途径指以葡萄糖为起始物经磷酸戊糖（HMP）途径的赤藓糖-4-磷酸(E4P)和糖酵解（EMP）途径中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)二者缩合形成 3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的过程；共同途径指从 DAHP 开始，经莽草酸（SHIK）、到达分支酸(CHA)的过程；余下的从 CHA 至 L-Trp 部分，则称为 L-Trp 分支途径（图1-2）。目前关于 L-Trp 的代谢工程研究大多集中在共同途径和 L-Trp 分支途径的改造上。
Glucose
图1-2 大肠杆菌中L-Trp的合成途径及相关调控
Fig.1-2 Metabolic pathways and regulation for biosynthesis of L-Trp in E.Coli
4.2 微生物合成L-色氨酸的调控机制
色氨酸的微生物合成代谢存在复杂的调控机制，从而严格控制着色氨酸的合成。
4.2.1 限速酶的反馈抑制
色氨酸的合成代谢中存在两个明显的限速酶: DAHP 合成酶和邻氨基苯甲酸( ANTA) 合成酶( 图 1-2) 。DAHP 合成酶催化中心代谢途径中的 PEP 和 E4P 生成 DAHP，严格控制着由中心代谢途径进入芳香族氨基酸共同途径的碳流量。大肠杆菌的 DAHP 合成酶由基因aroF、aroG和aroH编码的 3个同工酶组成，且这 3 个同工酶的酶活性分别受到酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制。而在谷氨酸棒杆菌里，只存在两种 DAHP 合成酶，分别由aro和aroⅡ编码。ANTA 合成酶则负责催化共同途径的末端产物CHA 生成 ANTA，从而进入色氨酸分支途
径。ANTA 合成酶由基因trpED编码，酶活性受到终端氨基酸色氨酸的反馈抑制［9］。
4.2.2 关键酶的转录调控
除酶活性受到反馈抑制作用外，一些关键酶的转录表达水平同样受到终端氨基酸的调控。大肠杆菌中，从分支酸到色氨酸的合成是由色氨酸操纵子完成的。在色氨酸操纵子的上游存在一个trpR基因，其编码 trpR阻遏蛋白参与色氨酸操纵子的转录调控。当胞内色氨酸的浓度高于某一阀值时，在 trpR 阻遏蛋白的作用下，操纵子的转录则受到阻遏。此外，色氨酸操纵子的转录还受到衰减子序列的调控。色氨酸操纵子序列中，在结构基因之前有一段由 162 核苷酸组成的前导序列。在转录过程中，当胞内色氨酸达到一定浓度时，这段核苷酸序列的二级结构则发生变化，进而阻止操纵子的继续转录［9］。
4.2.3 转运途径调控
培养液中的色氨酸被微生物转运至胞内进行吸收利用，是由特定的转运系统进行控制的。在大肠杆菌中，3 个色氨酸转运基因 mtr、tnaB和aroP 调控着色氨酸由胞外向胞内的转运。( 图 1-2) 。其中，mtr和tnaB基因分别编码色氨酸的高亲和性和低亲和性色氨酸通透酶，均专一性调控色氨酸由胞外向胞内的吸收; 而由aroP基因编码一种跨质膜双向运输芳香族氨基酸通透酶，除调控色氨酸的吸收外，还参与调控苯丙氨酸和酪氨酸的吸收［10］。但在谷氨酸棒杆菌
中，色氨酸的吸收则仅由基因aroP蛋白调控［11］。
4.2.4 其他调控机制
除上述调控机制外，色氨酸合成代谢还存在一些其它的重要调控机制。例如，微生物还通过色氨酸降解反应以及众多竞争途径来调节色氨酸的合成。大肠杆菌的tnaA基因编码色氨酸酶，虽然在高浓度的丙酮酸和氨条件下该酶能有效地催化丙酮酸、吲哚和氨合成色氨酸。但在正常情况下它只发挥降解色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨的作用，阻碍色氨酸的积累。因此，失活tnaA 基因有利于大肠杆菌积累更多的色氨酸［12］。此外，在色氨酸合成途径的关键节点还存在众多的竞争途径，进一步削弱流向色氨酸合成途径的碳流量。例如，对于共同途径的末端产物CHA，除参与色氨酸的合成外，还是另外两种芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸的共同底物，此外，它还参与叶酸、甲萘醌和泛醌等的生物合成。
5 增强L-色氨酸合成的代谢调控策略
5.1 抗反馈抑制作用酶的帅选
抗反馈抑制作用突变酶是微生物积累L-Trp的先决条件。在野生型大肠杆菌的无机培养过程中，AroG 和 AroF 同工酶的酶活占 DAHP 合酶总酶活的 99%以上，
