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两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。
原理依赖于限制性核酸内切酶，dna连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
一.t4dnaligase即t4dna连接酶，可以催化粘端或平端双链dna或rna的5’-p末端和3’-oh末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需atp作为辅助因子。
1.质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。
其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
[附加酶乌体系]vector3ugcutsmartbuffer5ul限制性内乌酶11ul限制性内乌酶21ul酶切体系一般选择50ul，试剂加好之后37°c孵育6~8小时，或适度延长时间，确保质粒酶乌全然。
内要一段时间震荡一下并Vergt以免液滴冷却至管盖上。
酶乌后载体通过切胶废旧线性化载体。
2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’端-保护碱基序列+限制性内切酶1酶切位点序列+基因正向引物序列-3’端（2）逆向引物：5’端的-维护碱基序列+限制性内乌酶2酶切位点序列+基因逆向引物序列-3’端的如果目的基因片段较长的话，可以选择pcr方式扩增目的基因片段[附加pcr扩充体系]ddh2o：14ul10xtaqbuffer：2ul10umdntp：1ul10umprimerf：0.5ul10umprimerr：0.5ul模板dna：1ultaq酶：1ul[可选pcr扩增条件](1)95℃：5min(2)35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物tm值决定，一般退火温度根据引物tm值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩充之后，首先必须展开琼脂糖凝胶电泳检验条带大小，然后通过胶废旧，赢得提纯目的片段产物.由于重新加入维护碱基，废旧产物须要展开双酶乌，双酶乌方法与质粒酶乌方法相同。
检测大肠杆菌内c-di-GMP水平的双荧光素报告质粒的构建及应用检测大肠杆菌内c-di-GMP水平的双荧光素报告质粒的构建及应用【引言】大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界的肠道菌，在生物医学研究中具有重要的实验模型作用。
在细菌中，细胞内c-di-GMP水平的调控对于生物膜形态、运动和生物膜中生物分子的浓度具有重要影响。
因此，对大肠杆菌内c-di-GMP水平的准确检测具有重要意义。
近年来，双荧光素报告质粒的构建及应用在大肠杆菌内c-di-GMP的检测中得到了广泛应用。
【报告质粒的构建】报告质粒的构建主要包括选取适合的载体和报告基因、构建报告基因的启动子和靶标区、进行质粒的克隆等步骤。
首先，选取具有较低背景荧光的载体并引入合适的报告基因，如荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP），用于检测c-di-GMP水平的变化。
接下来，设计合适的启动子来驱动报告基因的表达，在c-di-GMP水平变化时能够产生不同的荧光信号。
最后，进行质粒的克隆，将所构建的报告基因和启动子与载体进行连接，形成完整的双荧光素报告质粒。
【应用】报告质粒在大肠杆菌内c-di-GMP水平检测中发挥了重要作用。
通过将质粒导入到大肠杆菌中，研究人员可以通过监测荧光信号的变化来实时监测c-di-GMP水平的变化。
这种监测方法可用于研究c-di-GMP合酶（DGC）和c-di-GMP酶（PDE）对c-di-GMP水平的调控作用。
通过改变质粒中启动子和靶标区的序列，进一步可将报告质粒应用于筛选与c-di-GMP调控相关的基因或化合物。
此外，报告质粒还可用于研究不同环境条件下大肠杆菌内c-di-GMP水平的变化，为对该菌株的行为和适应性进行研究提供了有效工具。
【未来展望】尽管双荧光素报告质粒在大肠杆菌内c-di-GMP水平检测中已取得了显著成果，但在应用中仍存在一些局限性。
一方面，目前的质粒报告系统仍难以实现对c-di-GMP水平的定量分析，需要进一步改进和优化。
上海交通大学硕士学位论文双价抗虫基因植物表达载体p3300-bt-pta的构建及转基因烟草的初步检测姓名：***申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：武天龙;唐克轩20040101双价抗虫基因植物表达载体p3300-bt-pta的构建及转基因烟草的初步检测摘要虫害严重影响着农业生产但是随着转基因抗虫植物的大面积推广构建多价杀虫基因可能是延缓昆虫对转基因抗虫植物产生抗性的一种有效策略ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａＨｏｍｏｐｔｅｒａ现在已应用的苏云金杆菌毒蛋白Ｂｔ和ＣｐＴＩ基因主要是以棉铃虫红铃虫据报道半夏凝集素 ＰＴＡ粗提液对刺吸式同翅目害虫有显著致死作用设计构建了含有Bt.毒蛋白基因和半夏凝集素ｐｔａ基因的双价杀虫基因载体酶切分别含有Ｂｔ ＣｒｙＩＡ（ａ）和Ｂｔ ＣｒｙＩＡ（ｃ）基因的ｐＧＥＭ－４Ｚ质粒得到Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ基因启动子驱动的Ｂｔ ＣｒｙＩＡ（ａ）和Ｂｔ ＣｒｙＩＡ（ｃ）基因表达盒开环的ｐＣＡＭＢＩＡ３３００载体上形成中间载体ｐ３３００－Ｂｔ然后插入到用Ｓｍａ获得带有抗性基因的双价抗虫基因表达载体ｐ３３００－Ｂｔ－ｐｔａ获得80株抗除草剂的转双价抗虫基因的烟草植株ＲＴ－ＰＣＲ等分子生物学的方法分析关键词半夏凝集素ｐｔａ基因ａ／ｃ载体构建CONSTRUCTION OF PLANT EXPRESSIONVECTORS P3300-BT-PTA CONTAINING BINARY INSECT RESISTANCE GENES AND THEIREXPRESSION IN TOBACCOS ＡＢＳＴＲＡＣＴ Pests threaten agricultural production seriously. The genetic engineering of insect-resistant plant has been proved very effective in the Integrated Pest Management Program. On the other hand,pests will developing resistance to insect-resistant transgenic plants with the wide planting of these plants.The pests of Lepidoptera and Homoptera are mainly serious menace to the crops ,and the Lepidopteras such as Helicover paassulta(Guenée)Pink boll worm and Corn borer are prevented and cured by Bt and CpTI proteins which have been taken into practice now .It was reported that rough extract from Pinellia tenata has obvious fatal effect on the Homopteras (e.g.cotton aphid).According to the different work mechanism and complemental pest-resistant patterns of the Bt. and PTA proteins, the plant expressing vectors containing those binary insect resisitance genes bt and pta are designed and constructed.Plant expression vectors p3300- CryIA(a)-pta and p3300- CryIA(c)-pta with binary insect resistance genes were constructed by inserting expression cassettes of Bt CryIA(a)gene or Bt CryIA(c)which were cut from pGEM-4Z plasmids with restriction enzyme Hindand SmaCryIA(c) genes were under the control of Ubiquitin promoter and NOS terminator and the pta gene was under the control of CaMV 35S promoter and NOS terminator respectively.The leaf discs of Nicotiana tobacco were infected by Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 containing these plant expression vectors. Phosphinothricin resistant plants from individual transformation events were obtained, The regenerated plants were identified by PCR and RT-PCR. PCR checking confirmed the integration of foreign genes, And the RT-PCR shows the Bt gene and pta gene have been inserted into the genomic DNA of tobacco.ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ： Ｂｉｎａｒｙ ｉｎｓｅｃｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓＢｔＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ 上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。
44卷 2期2004年4月微生物学报Acta Microbiologica SinicaV ol.44April N o.22004基金项目:国家“863计划”(2001AA214201)3通讯作者。
T el :86-21-62479808转323;Fax :86-21-62890729;E -mail :zhucb @作者简介:张丕燕(1969-),男,江苏沛县人,博士研究生,研究方向为丝状真菌的基因工程研究。
T el :86-21-62479808转304;E -mail :zhang 2piyan @收稿日期:2003-06-23,修回日期:2003-10-27顶头孢霉pcb AB -pcb C 双向启动子区域的克隆与应用张丕燕 朱春宝3 朱宝泉(上海医药工业研究院 上海 200040)摘 要:用PCR 方法从丝状真菌顶头孢霉中克隆出全长113kb 的pcb AB-pcb C 双向启动子DNA 片段,通过转化子对博莱霉素的抗性证明了该启动子在顶头孢霉中的双向启动功能。
另外,利用所克隆的pcb AB-pcb C 双向启动子构建了一个用于顶头孢霉转化的质粒pYG 13,并成功地将该质粒转化入顶头孢霉。
pYG 13含有博莱霉素抗性基因和透明颤菌血红蛋白基因(vgb ),S outhern 杂交和C O 结合实验分析显示vgb 整合到顶头孢霉的基因组DNA 中并表达了有活性的透明颤菌血红蛋白。
关键词:顶头孢霉,pcb AB-pcb C 双向启动子区域,转化中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号000126209(2004)022******* 顶头孢霉是工业上用于发酵生产头孢菌素C 的重要丝状真菌,过去的30年来,诱变技术、生化筛选技术和原生质体融合技术的应用使得头孢菌素的产量有了大幅度的提高。
在β-内酰胺产生菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum )、构巢曲霉(Aspergillus nidulans )和顶头孢霉(Cephalosporium acremo 2nium )中,基因pcb AB 和pcb C 分别编码δ-(L-α-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D -缬氨酸合成酶[δ-(L-a-aminoadipyl )—L-cystei 2ny l-D -valine synthetase ]和异青霉素合成酶,用于催化β-内酰胺抗生素生物合成途径中前两步的反应。
通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态和液态发酵中的青霉素产量（张蕊）摘要：产黄青霉各个菌株中青霉素产量的高低受到一种含有全部青霉素生物合成基因簇的粘性质粒的影响。
该质粒文库构建于一个新开发出的粘性质粒载体——IztapaCos中，IztapaCos质粒载体适合将较大的DNA片段复制并直接转化进入真菌细胞，并以对腐草霉素（phleomycin）的抗性作为选择标记。
实验中分别在液态发酵(SmF)和固态发酵(SSF)中对基因扩增应用于青霉素产量的影响进行了评估。
由青霉素低产株Wis54-1255的转化菌株在固态和液态发酵中的青霉素产量分别提高了67.3%和28.3%，由高产株P2-32的转化菌株产量则分别提高了92.9%和158.4%。
其中P2-32菌株原本已含有大约14个青霉素生物合成基因簇的拷贝，这说明了扩增基因含量的策略在高拷贝数的菌株中同样有效。
文中将对以上两种菌株在两种发酵条件下的不同表现以及此法在青霉素工业化生产中的推广进行讨论。
关键词：青霉素基因簇扩增青霉素产量提高液态及固态发酵前言人们曾对产生青霉素的真菌——产黄青霉（Penicillium chrysogenum）采取过多种不同的菌株优化方案，包括随机突变和基因工程。
当三个青霉素合成的结构基因(pcbAB, pcbC和penDE)被鉴定(Dı´ez et al.1990;Smith et al.1990)出来后，这些基因的过表达就成为了被应用的方法之一。
对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的研究指出基因acvA（pcbAB）是控制青霉素产量的关键基因，而基因ipnA（pcbC）和aat（penDE）则不然。
当基因acvA过表达时，青霉素的产量增加了30倍（Kennedy&Turner1996）。
然而，用相同的可诱导启动子诱导过表达基因ipnA和aat时，尽管相关酶的活性得到了很大提高，如异青霉素N合成酶活性提高40倍而异青霉素N乙酰基转移酶提高8倍（Ferna´ndez-Can˜o´n&Pen˜alva1995），但对青霉素产量只有微弱的影响（产量提高了25%）。
创新的双质粒系统：安全性与功能性的结合在现代生物技术中，基因工程微生物（GEM）的开发已成为解决环境污染问题的有力工具。
中科院动物研究所伍一军研究组的最新研究展示了如何通过创新的双质粒系统，构建出具有荧光特性、农药降解活性和可诱导性自杀能力的GEM，从而在提高环境应用安全性的同时，增强了其功能性。
双质粒系统的设计该双质粒系统由两个功能质粒组成：一个质粒携带自杀基因，另一个质粒则包含荧光蛋白基因和农药降解酶基因。
自杀基因质粒含有去除前导肽的核酸酶自杀基因，来自Serratia marcescens，其表达可以通过阿拉伯糖诱导。
这种设计使得GEM在完成其任务后，可以通过外部诱导安全地自我消除，防止对环境造成长期影响。
荧光特性与农药降解活性功能质粒pL-EGFP-OPH携带有机磷水解酶（OPH）基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因。
这使得GEM不仅能够在环境中被轻易追踪和监测，还能高效地降解农药，转化为无害物质。
荧光特性为研究者提供了一种非侵入性的监测手段，以确保GEM的活动范围和降解效率。
可诱导性自杀能力自杀基因的引入为GEM的环境应用提供了一个安全开关。
在GEM完成其环境修复任务后，研究者可以通过添加阿拉伯糖来诱导这些细菌自杀，从而有效控制GEM的生命周期，防止其无限制地繁殖和扩散。
安全型GEM的研究成果伍一军研究组的工作不仅展示了GEM在环境修复中的潜力，还强调了安全性在GEM设计中的重要性。
通过这种双质粒系统，研究者成功地平衡了GEM的功能性和安全性，为其在环境中的实际应用提供了新的可能性。
结论这项研究的成功，为未来GEM的设计和应用提供了重要的参考。
它证明了通过精心设计的遗传元件，可以创造出既能有效解决环境问题，又能在必要时自我消除以保护生态平衡的GEM。
这种创新的双质粒系统为环境生物技术的发展开辟了新的道路，使得GEM的应用更加安全、可控和高效。
双靶点载体构建实验原理今天来聊聊双靶点载体构建实验原理的那些事儿。
你知道搭积木吗？其实双靶点载体构建有点像搭积木，每个部分都有它独特的功能，组合起来就能实现特定的目标。
我们先来说说啥是双靶点载体构建吧。
简单来说，载体就像一艘小船，能够把我们想要的东西（在这个实验里就是和双靶点有关的基因片段之类的）运到一个地方，这个地方通常就是细胞里面啦。
我刚开始接触这个实验原理的时候，真的觉得超级困惑。
就好比你去一个新地方，周围全是不认识的路。
后来我慢慢发现这里面有很多有意思的地方。
那这双靶点载体构建的原理到底从哪说起呢？这就要说到我们的目标是啥了。
我们的目标就是构建一个能够同时作用于两个靶点的载体。
就像是打造一把特殊的钥匙，这把钥匙能同时开两把锁。
为什么要同时作用于两个靶点呢？打个比方，就像你要消灭老鼠，但是光堵一个洞是不够的，你要是能同时堵住它两个重要的逃生通道，那抓住老鼠的成功率就大大提高了。
在医学研究里，这两个靶点可能是跟疾病相关的两个关键因素，同时对它们下手，治疗疾病的效果可能就更好。
从实际操作的角度来看，我们得先找到我们需要的材料。
这些材料就像厨师做菜的食材一样重要。
比如说我们要找到与两个靶点对应的基因序列，这就好比找到做特定菜品的独门配方。
然后呢，通过各种生物技术手段，像分子克隆这类技术，把这些材料连接到载体这个“小船”上。
这里面用到的技术就像各种榫卯结构一样精确，一点都不能出错。
说到这里，你可能会问，那怎么保证我们搭建好的这个双靶点载体能够正常工作呢？这就涉及到很多后续的检测步骤了。
有点像汽车造好之后要经过一系列严格的检测一样。
我们要把构建好的载体转染到细胞里，观察细胞的各种反应来确定载体是不是真的能同时作用于那两个靶点。
这里面还有很多需要注意的地方呢。
比如材料的纯度、反应的条件等等，这些细节就像造桥时每个桥墩的稳定性一样关键。
要是某个环节出现问题，那我们的双靶点载体可能就不能很好地发挥作用了。
