分子遗传图谱构建

分子标记技术的应用目前，分子标记技术在植物学研究中得到了广泛的应用，如构建遗传图谱、基因定位和克隆及新基因的寻找、遗传多样性和物种亲缘关系研究、系统进化发育、种质资源鉴定和保存、分子标记辅助选择育种等方面。

1 构建遗传图谱遗传图谱是随着各类分子标记的发展而形成的现代育种观念，具有极其主要的意义，可用来定位和标记目的基因，揭示多基因性状的遗传基础，推动标记辅助育种在生产上的应用等。

长期以来，各种植物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的，建成遗传图谱的植物种类很少，而且图谱分辨率大多很低，图距大，饱和度低，因而应用价值有限。

DNA分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一。

1980年，Bostein首次提出用RFLP作为遗传标记构建连锁图的设想。

此后，RFLP首先被应用于人类遗传学研究，并于1987年建成了人的第一张RFLP图谱，其饱和度远远超过了经典的图谱。

近几十年来，各种分子标记技术如RAPD、SCAR、SSR、AFLP、SNP等都有成功用于农作物或林木遗传图谱构建的实例，多种分子标记技术结合运用能得到密度更高，遗传距离更大的遗传图谱。

2基因定位基因定位即将具有某一表型性状的基因定位于分子标记连锁图中，包括对质量性状(如植物花色、叶形、高矮等，主要由单基因编码)和数量性状(如花期、抗逆性等，由连锁基因编码)的基因定位。

质量性状基因的定位有近等基因系(Near Isoallele Lines，NILs)和群分法(Bulked Segregation Analysis，BSA)。

数量性状基因(Quantitative Trait Locus，QTL)的定位主要有以标记为基础的分析法(MB法)、以性状为基础的分析法(TB法)和区间作图法。

同样，RFLP和RAPD、SCAR、SSR、ISSR、AFLP等标记方法在基因定位中也取得了较大的进展。

如Martin等在用144个随机引物进行的RAPD标记中找到3个标记同番茄抗茎腐病基因PtO连锁，并经RFLP分析，将这3个标记定位于RFLP连锁图的第5条染色体上。

分⼦标记遗传图谱构建⽅法---完整分⼦标记遗传图谱的构建检测出的每个分⼦标记反映的都是相应染⾊体座位上的遗传多态性状态。

为了有效地分析利⽤分⼦标记所提供的遗传信息，⼈们希望知道不同分⼦标记在染⾊体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分⼦标记的遗传连锁图谱。

利⽤DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是⼀样的。

其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择⽤于建⽴作图群体的亲本组合；建⽴具有⼤量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍⽣系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进⾏连锁分析，构建标记连锁图。

⾄今为⽌，已构建了许多植物的⾼密度分⼦标记连锁图。

本章侧重介绍利⽤DNA标记构建分⼦遗传连锁图谱的原理与⽅法。

第⼀节作图群体的建⽴要构建DNA标记连锁图谱，必须建⽴作图群体。

建⽴作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体⼤⼩的确定等。

⼀、亲本的选配亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适⽤范围。

⼀般应从四个⽅⾯对亲本进⾏选择，⾸先要考虑亲本间的DNA多态性。

亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可⽤地理的、形态的或同⼯酶多态性作为选择标准。

⼀般⽽⾔，异交作物的多态性⾼，⾃交作物的多态性低。

例如，⽟⽶的多态性极好，⼀般⾃交系间配制的群体就可成为理想的RFLP作图群体；番茄的多态性较差，因⽽只能选⽤不同种间的后代构建作图群体；⽔稻的多态性居中，美国康乃尔⼤学S.D.Tanksley实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和⽖哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。

在作物育种实践中，育种家常将野⽣种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA多态性⾮常丰富。

第⼆，选择亲本时应尽量选⽤纯度⾼的材料，并进⼀步通过⾃交进⾏纯化。

第三，要考虑杂交后代的可育性。

遗传图谱绘制及其在种群遗传分析中的应用遗传图谱是绘制个体或种群基因组的一种图形化表示方法。

遗传图谱可以揭示基因之间的相互关系，帮助科学家理解和研究遗传信息传递的方式。

在种群遗传学中，遗传图谱的绘制和分析可以提供有关种群遗传结构、基因流动和基因多样性等重要信息，对于保护和管理野生物种以及推动农作物育种具有重要意义。

遗传图谱的绘制通常基于分子标记技术，如DNA分子标记和SNP分析。

DNA分子标记可以帮助科学家识别基因组上具有特定遗传差异的位点，从而绘制出遗传图谱。

通过对多个个体或种群的DNA样本进行分析，我们可以得到一个具有多个位点和多个个体的遗传图谱。

在绘制遗传图谱时，首先需要选择合适的标记技术。

常用的标记技术包括PCR-RFLP、SSR、AFLP和SNP等。

每种标记技术都有其优点和限制，因此在选择标记技术时需要充分考虑研究目的和样本特点。

其次，需要选择合适的个体或种群进行样本收集。

在种群遗传分析中，样本的选择是至关重要的。

一般来说，样本应该具有代表性，包括来自不同地理区域或群体的个体。

此外，样本的数量也是影响遗传图谱绘制的重要因素，较大的样本数量可以提供更准确和可靠的结果。

一旦获得了样本，就可以通过分子标记技术对其进行分析。

例如，可以使用聚合酶链反应（PCR）扩增位点DNA，并使用限制性内切酶（RFLP）或测序等方法对扩增产物进行检测。

通过将多个位点的数据组合起来，就可以绘制出遗传图谱。

绘制好的遗传图谱可以用来研究种群的遗传结构和基因流动。

遗传结构是指种群中不同个体之间的遗传联系和分离程度。

遗传图谱可以帮助我们判断不同个体或群体之间的遗传距离，揭示种群的遗传联系和分离情况。

此外，遗传图谱还可以用来分析种群的基因流动，即不同个体或群体之间基因交换的程度。

基因流动对于种群的遗传多样性和适应力具有重要影响，因此对基因流动的研究在物种保护和育种中十分重要。

除了研究种群遗传结构和基因流动外，遗传图谱还可以用来评估种群的遗传多样性。

茶树高密度遗传图谱构建及重要性状QTL定位一、本文概述茶树，作为一种重要的经济作物，在全球范围内具有广泛的种植和应用。

随着分子生物学和基因组学的发展，茶树遗传图谱的构建及重要性状QTL（数量性状座位）定位成为了茶树遗传育种和分子生物学研究的热点。

本文旨在通过构建茶树的高密度遗传图谱，实现对茶树重要经济性状的精准QTL定位，为茶树的遗传改良和分子育种提供理论基础和技术支持。

我们将对茶树高密度遗传图谱的构建方法进行详细阐述，包括遗传材料的选择、基因型鉴定、图谱构建算法的选择等关键步骤。

随后，我们将对构建完成的高密度遗传图谱进行质量评估，以确保其准确性和可靠性。

在得到高质量的遗传图谱后，我们将进行重要性状QTL的定位研究。

我们将选择茶树的关键经济性状，如产量、品质、抗逆性等作为研究目标，利用遗传图谱和表型数据，结合统计分析方法，精准定位控制这些性状的QTL。

本文的研究结果将有助于揭示茶树重要经济性状的遗传基础，为茶树的遗传改良和分子育种提供重要的理论依据。

本文的研究方法和结果也将为其他作物的遗传图谱构建和QTL定位研究提供参考和借鉴。

二、材料与方法本研究采用了多个茶树品种作为实验材料，包括但不限于高产量、优质口感、抗病性强等具有重要经济价值的茶树。

所有的样本都是在茶树生长的关键阶段，如春芽期和夏茶期，经过严格的田间管理后采集的。

采集的样本经过清洗、干燥、研磨后，保存于-80℃的超低温冰箱中，以备后续的DNA提取和遗传分析。

使用改良的CTAB法从茶树叶片中提取高质量的基因组DNA。

提取的DNA经过质量检测后，使用高通量测序平台进行全基因组测序。

测序数据经过质量控制和预处理后，进行序列拼接和组装，获得茶树的基因组序列。

利用茶树基因组序列，结合高通量测序获得的SNP（单核苷酸多态性）数据，通过生物信息学分析，筛选出高质量的SNP标记。

然后，利用这些SNP标记，结合已知的遗传连锁图谱信息，构建茶树的高密度遗传图谱。

水稻分子遗传图谱的构建、重要基因的分子标记定位及应用研究完成单位：四川农业大学中国科学院遗传与发育生物学研究所中国水稻研究所主要完成人：李仕贵李平邓晓建吴先军朱立煌钱前谭震波陈学伟何平周开达汪旭东沈利爽曾大力鉴定组织单位：四川省科技厅鉴定时间：2004.5.11成果水平：国际领先成果简介：本研究发球植物分子生物学、植物遗传育种学领域的应用基础研究。

本研究首次以籼粳杂交（窄叶青8号/京系17）F和（杂交稻籼型恢复系主630/粳1型广亲和系02428）F的两个DH群体为基础，利用RFLP、FAPD和SSR标记构建了两张1分子遗传图谱，分别覆盖水稻基因组1962cM和2000cM，研究了水稻染色体端粒相关的DNA序列，发现了RFLP标记在水稻基因组的零等位现象。

以上述分子遗传图谱为基础，率先对水稻光合作用相关性状、耐盐和耐冷、再生力、株高构成与抗倒性、籼粳交育性生殖障碍和籽粒灌浆充实、恢复基因、花药培养力、蛋白质和脂肪含量等性状相关的QTL进行遗传分析和定位研究。

通过不同生态环境的比较定位，系统地研究了控制稻火品质和农艺性状的QTL，QTL与环境的互作，确定了一些与稻米品质和农艺性状相关的主效基因位点，这对QTL的精细定位，克隆和分子标记辅助选择，提高产量和改良稻米品质具有重要意义。

发现、定名并定位了一批控制重要性状的新基因，包括抗稻瘟病基因pi-d(t)1和pi-d(t)2控制生育期的早熟显性基因Ef-cd(t)和迟熟隐性基因lf-3(t)、温敏显性核不、育基因TMS、水稻寡分蘖基因ft1、小粒矮杆基因d162(t)、稀穗基因lax，并通过染色体步行法克隆了基因pi-d(t)2。

利用近等基因系对杂交稻主效恢复基因Rf-4和萍乡显性核不育基因Ms-p进行了精细定位，为基因克隆奠定了基础。

利用分子标记对首次发现的水稻早代稳定材料进行了相关研究，获得了与早代稳定现象相关的分子标记。

利用分子标记辅助选择技术与早代稳定材料相结合，建立了高效、多个优良基因聚合的育种新体系，育成了一批优质、抗稻瘟病不育系和抗白叶枯病恢复系，并组配一批杂交稻新组合，其中3个通过审定，9个正在参加各级区试，示范推广面积186万亩，创社会经济效益35571万元。

名词解释1. 分子育种：利用DNA相关的理论和技术展开的育种工作包括转基因和分子标记辅助选择两方面2. 前景选择：用目标性状的连锁标记对目标基因的选择称为前景选择。

3. 背景选择：用基因组中均匀分布的标记对基因组中除了目标基因之外的其它部分（即遗传背景）的选择，称为背景选择4. 基因聚合：基因聚合（gene pyramiding）就是将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个基因组中5. 基因转移：基因转移（gene transfer）或基因渗入（gene transgression）是指将供体亲本（一般为地方品种、特异种质或育种中间材料等）中的有用基因（即目标基因）转移或渗入到受体亲本（一般为优良品种或杂交品种亲本）的遗传背景中，从而达到改良受体亲本个别性状的目的6. 转基因育种：作物转基因育种就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定7. 基因定位：基因定位（Mapping of genes ）是指通过遗传作图的方法，确定基因与遗传标记之间的关系。

8. 遗传标记：遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。

遗传标记在重组实验中多用于测定重组型和双亲型。

9. 遗传多态性：遗传多态性（genetic polymorphism）同一群体中两种或两种以上变异类型并存的现象，其中最少的一种类型也并非由于反复突变才得以维持，并且变异类型不包括连续性变异如人的高度等10. 遗传图：遗传图（genetic map），又称为连锁图(linkage map），是指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离11．遗传作图：是指应用遗传学技术构建能显示基因以及其他序列待征在基因组上位置的图，遗传图谱的构建即遗传作图(Genetic mapping) 。

它是利用遗传学的原理和方法，构建能反映基因组中遗传标记之间遗传关系的图谱。

或者是：制作遗传标记连锁图。

分子标记遗传图谱的构建检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。

为了有效地分析利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。

利用DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。

其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。

至今为止，已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图。

本章侧重介绍利用DNA标记构建分子遗传连锁图谱的原理与方法。

第一节作图群体的建立要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。

建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。

一、亲本的选配亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。

一般应从四个方面对亲本进行选择，首先要考虑亲本间的DNA多态性。

亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可用地理的、形态的或同工酶多态性作为选择标准。

一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低。

例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的群体就可成为理想的RFLP作图群体；番茄的多态性较差，因而只能选用不同种间的后代构建作图群体；水稻的多态性居中，美国康乃尔大学S.D.Tanksley实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和爪哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。

在作物育种实践中，育种家常将野生种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA多态性非常丰富。

第二，选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。

第三，要考虑杂交后代的可育性。

亲本间的差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间的重组率偏低，并导致严重的偏分离现象，降低所建图谱的可信度和适用范围；严重的还会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分离群体的构建。

兰花分子图谱的构建兰花(Cymbidium)具有很高的观赏价值、经济价值和文化价值,目前其新品种的选育多采用杂交育种方法,育种周期长,效率低。

分子标记辅助选择育种能有效缩短育种周期,提高育种效率和效果,但迄今兰花上未见到有关分子图谱构建和分子标记辅助选择的研究报道。

本研究采用‘玉女兰’(C.‘Yunv’)和‘黄叶红花墨兰’(C.sinense‘Huangyehongmo’)杂交构建F1作图群体,通过转录组测序开发SSR标记,并利用这些标记构建兰花分子遗传图谱。

主要研究结果如下:1.作图群体的构建。

对‘玉女兰’ב黄叶红花墨兰’杂交种子进行离体培养,共获得513个株系。

对各株系的组培快繁特性和试管苗性状进行观测,结果表明,各株系在中间繁殖体增殖、分化能力以及芽苗生长速度上差异明显,试管苗形态多样,有松散、较紧凑和紧凑等各种类型,叶片长和叶片宽差异明显,说明杂种后代群体具有遗传多样性。

从该群体中随机选取94个后代组成作图群体,该群体在组培快繁特性、株型和叶片性状上具有多样性,各类型的比例与原杂种后代群体相近。

2.兰花转录组测序和SSR标记开发。

对‘企剑白墨墨兰’(C.sinense‘Qijianbaimo’)的营养器官和生殖器官进行转录组测序,共获得51764个unigenes,利用MISA软件对1 kb以上的unigenes 进行SSR位点的筛选,得到4419个SSR位点,出现频率为8.54%。

墨兰转录组中的SSR类型丰富,从二核苷酸到六核苷酸重复基序均有分布,主要集中在二和三核苷酸,分别占57.00%和33.76%,AG/CT核苷酸基序占总核苷酸基序数的比例最高,为3.73%。

利用Primer Premier 5.0进行引物设计,从4419对SSR引物中筛选出了318对SSR引物,从大花蕙兰转录组中获得185对SSR引物。

以‘玉女兰’和‘黄叶红花墨兰’为材料进行通用性和多态性引物筛选,318对墨兰SSR引物共有235对引物在双亲中扩增出清晰的条带,其有效扩增率为73.89%,61对引物具有多态性,占可扩增引物的19.18%;185对大花蕙兰SSR引物中有143对引物扩增出清晰的条带,有效扩增率为77.29%,17对引物扩增出多态性条带,占可扩增引物的9.19%。

一、名词解释1．生物技术：以现代生命科学技术成果为基础设计、改造生物体，生产人类需要的产品。

2．外植体：由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。

3．器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程。

4．花粉的二型性：在花药/花粉培养时，由于对培养条件的反应不同，花粉在形态上形成两种类型，一类是具胚性的，在烟草和大麦中，花粉小，染色浅，为胚性的；另一类为花粉大，染色深，朝成熟花粉方向发展。

这种现象即花粉的二型性。

5．原生质体：指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。

6．Ti质粒：Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA 分子。

7．图示基因型：用标记推测出个体基因组组成状况的连续基因型，这种连续的基因型能直观地用图形表示出来,称为图示基因型。

8．分子标记：指在分子水平上可标识的遗传多态性。

主要也指DNA(或核苷酸序列)的多态性。

9．植物细胞工程: 指以细胞为基本单位,在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。

10．脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程11．体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。

12．双单倍体：由单倍体加倍形成的纯合系。

13．体细胞杂交：指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。

14．T-DNA: T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。

16．遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。

21．原生质体：指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。

22．植板率：即形成愈伤组织的原生质体数量占所培养原生质体总数的百分比。

23．对称杂种: 指杂种中具有融合双亲全部的核遗传物质28．CPW13M：分离原生质体使用的含有13%甘露醇的CPW盐溶液29．对称融合: 是亲本原生质体在融合前未进行任何处理的一种融合方式。

30．Onc卸甲载体：去除Ti质粒T区左右臂之间的激素合成基因后的载体。