下载文档原格式
第一部分质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验一质粒DNA的小量制备1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌器等。
4．试剂Pinpoint™xa-3质粒载体菌，pBS-CHI载体菌，LB培养基1000ml（含100µg/ml氨苄青霉素），葡萄糖/ Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
5．实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200ml ddH2O 搅拌完全溶解，用约200ml 5N NaOH调pH至7.0，加ddH2O 至1L，121°C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60ml 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd H2O至100ml），75%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDT A pH8.0）；10mg /ml RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（1 21°C 30min）。
1.基因工程的基本过程：目的基因+载体—（酶切、连接）重组子—（转化或转染）宿主细胞—选择、筛选（—（导入）表达体系—目的基因表达）—目的基因扩增—目的基因表达2.基因工程的工具：1.基因操作的车间——大肠杆菌和病毒：优点；2.获得基因片段的工具——限制性内切核酸酶：剪刀，回文结构，类型；3.连接基因片段的工具酶——连接酶：浆糊，磷酸二酯链，ATP，NAD+；4.基因操作的载体——质粒和病毒。
3.亚克隆：1.将大片段克隆子的DNA重新打断成小片段，然后分别克隆到新的载体中，供进一步研究；2.通指将DNA片段从一个载体穿梭克隆到另一个载体的过程。
4.限制酶的命名原则：①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名; 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名。
②第四个字母代表宿主菌的株或型，正体。
③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示，正体写在第4个字母之后，字母间无间隔。
例：EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ5.Ⅱ型限制酶分子内切酶与甲基化酶不在一起；识别位点4-6bp，多为回文序列；切割位点在识别序列内或附近特异切割；限制与甲基化是分开的反应；辅因子为Mg2+；种类多，用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，Ⅱs型识别序列和切割位置特殊。
6.限制酶识别序列长度(n)：一般为4-8个碱基对，最常见6bp。
识别位点出现频率：4n7.Ⅱ限制酶切割双链DNA产生3种不同的末端类型：1.对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5’突出和3’突出的粘性末端两种；2.平末端：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低100倍左右；3.非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。
即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。
8.限制酶的反应条件：温度大多数为37℃，储存于50%甘油里，多数为10×buffer，有些限制酶用2×buffer，一些限制酶还需添加BSA（牛血清白蛋白）。
绪论第一节The birth of Genetic Engineering一．基因工程的定义在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
二．基因工程诞生的理论基础1.DNA是遗传物质（1）肺炎双球菌转化实验（2）噬菌体转染实验2.DNA双螺旋结构三．基因工程诞生的技术突破1.限制性内切酶（restriction enzymes）2. DNA连接酶（ligase）3.载体（vector）4.感受态体系(competence)5.琼脂糖凝胶电泳6.DNA测序技术四．基因工程的诞生1.Berg的开创性实验2. Boyer-Cohen实验六．基因工程的特征1.跨物种性2.无性扩增七．基因工程的主要操作内容1.目的基因的获取2.重组体的制备3.重组体的转化4.克隆鉴定5.目的基因表达第二节基因工程的安全性一、基因工程的安全隐患1.对环境的影响2.新型病毒的出现3.癌症扩散4.人造生物扩散二、重组DNA研究的安全准则1.公众的担忧2.专家的态度3.制定安全规则4.基因工程的安全措施（1）实验室的物理安全分4级：P1—P4级。
（2）实验室的生物安全分3 级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。
（3）载体的安全第三节基因工程的应用一、基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率（1）提高CO2的固定率（2）提高光能吸收率和转化率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物二、基因工程在工业中的应用1.纤维素的开发利用2.酿酒工业三、基因工程在医药上的应用1.用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.技术设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗四、基因工程在环境保护中的应用1.检测水污染2.生物降解第四节基因工程技术的商业化发展一、商业投资支持现代生物技术研究二、基因工程商业化特点1.技术密集型（1）产品来源于实验室（2）科学家往往就是公司的领导人2.市场扩张迅速3.投入巨大4.风险太高5.产品不断增加6.研究专一、产品专一7.医学生物技术产业进展最快8.专门为基因工程实验提供研发试剂的公司第一章基因工程的主要技术原理第一节DNA的提取与纯化一、质粒DNA的提取1 .碱抽提法提取质粒DNA（1）原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
基因工程细胞工程知识点汇总一、基因工程（一）基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
（一）基因工程的基本工具1•“分子手术刀”一一限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2. “分子缝合针” 一一DNA连接酶⑴两种DNA连接酶（E - coliDNA连接酶和T4DNA!接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E - coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA1接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
⑵与DNA 聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA1接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3. “分子运输车”一一载体（1）载体具备的条件：① 能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒（二）基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1. 目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
2. 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3. PCR技术扩增目的基因(1)原理：DNA双链复制(2)过程：第一步：加热至90〜95C DNA军链；第二步：冷却至U 55〜60C,引物结合到互补DNA 链；第三步：加热至70〜75C,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
