吉林大学中日联谊医院甲状腺外科孙辉主任

酶解鹿茸肽的制备、纯化及抗氧化活性王华;黄宜兵;高科翔;孙辉;高忠礼【摘要】利用一种工业用碱性蛋白酶对新鲜梅花鹿鹿茸进行水解,制备得到生物活性肽.首先,考察了酶用量、底物浓度和反应时间对水解反应的影响,确定了最佳水解条件为酶与底物质量比1:150,底物与溶剂质量比1:13,水解时间60 min.其次,利用硫酸胺分级沉淀法制备了鹿茸多肽粗提液,同时采用缓冲液保护其活性,再经Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离纯化,得到了具有最强抗氧化活性的鹿茸肽组分(VAP-B).最后,利用制备型高效液相色谱柱对VAP-B进一步纯化,得到了分子量在800以内的小肽活性组分(VAP-B1),其蛋白含量为70.45%.在此基础上,对小肽活性组分VAP-B1进行了理化性质分析,检测其抗氧化活性,包括清除超氧阴离子、羟自由基以及抗脂质过氧化的能力和还原能力.实验结果表明,当鹿茸肽VAP-B1浓度为20 mg/mL时,对邻苯三酚自氧化的抑制率达到91.9%,有明显的清除超氧阴离子的作用;当浓度为10 mg/mL时,对羟基自由基的清除作用达到100%,且在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系.此外,鹿茸肽VAP-B1还具有一定的防止脂质过氧化和还原的作用.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2010(031)012【总页数】6页(P2390-2395)【关键词】鹿茸肽;碱性蛋白酶;酶解;抗氧化活性【作者】王华;黄宜兵;高科翔;孙辉;高忠礼【作者单位】吉林大学中日联谊医院,长春,130033;吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室,长春,130021;吉林大学中日联谊医院,长春,130033;吉林大学中日联谊医院,长春,130033;吉林大学中日联谊医院,长春,130033【正文语种】中文【中图分类】O629;Q505鹿茸取自梅花鹿(Cervua Nippon Temminck)尚未角化的幼角.《本草纲目》中记载，鹿茸能生精补髓，养血益阳，强筋键骨.鹿茸中含有多种生物活性物质，能够促进机体的生长发育和新陈代谢［1］，增强机体的免疫功能［2，3］，对神经系统和心血管系统具有良好的调节作用，对骨折及创伤愈合有促进作用［4～6］，它能在短期内迅速生长发育成具有成骨、造血、神经与表皮生长、生毛与血管发育的综合器官，说明鹿茸在骨化之前贮存了大量的生长因子［7］.临床上鹿茸被用于多种疾病的治疗，并取得了良好的效果.陈书明等［8］报道，天然鹿茸醇提物可提高小鼠清除自由基的能力，增强小鼠的抗氧化作用.但关于梅花鹿鹿茸的酶解多肽是否具有抗氧化活性作用迄今尚未见报道.本文利用一种工业用碱性蛋白酶水解新鲜梅花鹿鹿茸，并通过正交试验对水解条件进行了优化，采用缓冲溶液保护鹿茸肽活性及硫酸胺分级沉淀法制备了鹿茸多肽粗提液，依次经过离心、过滤、Sephadex G-25凝胶层析柱分离和制备型高效液相色谱柱纯化分离，得到一个分子量在800之内的小肽活性组分，并对其抗氧化性进行了详细的研究，为鹿茸深加工以及开发抗衰老的低分子量鹿茸肽药物提供了理论依据.新鲜成年梅花鹿鹿茸(二杠)购自长春市双阳区鹿乡亨达鹿产品经销处;碱性蛋白酶Alcalase购自Novo-Nordisk公司(丹麦);HPLC级乙腈购自DIKMA公司(美国);亚油酸(Linoleic acid)购自Fluka公司，其它试剂均为国产化学纯.UV2550型紫外分光光度仪及LC-6A制备型高效液相色谱(Shimadzu公司);HD-2000型紫外检测器(上海嘉鹏科技有限公司).1.2.1 鹿茸的预处理参照文献［8］方法进行鹿茸的预处理.1.2.2 鹿茸样品水分含量测定参照文献［9］报道的干重法测定样品中水分含量，水分(%)= G/W×100% ，其中G为样品干燥后失去的质量(g);W为样品质量(g).1.2.3 鹿茸样品总氮含量测定采用微量凯氏定氮法［10］测定样品中总氮含量. 1.2.4 酶解正交试验设计利用正交实验确定酶解新鲜鹿茸的最佳工艺条件，选择酶浓度(A)，底物浓度(B)及时间(C)作为试验因子，采用L9(34)正交试验设计，水解效果以水解产物的抗氧化性为依据.实验选用碱性蛋白酶作为催化剂，与一般蛋白酶相比，碱性蛋白酶具有热稳性好、酶切位点多、价格便宜且用途广泛等优点. 1.2.5 酶解鹿茸蛋白水解度的计算酶解鹿茸蛋白的水解度(DH)可以根据消耗的碱量进行控制，即pH-stat法［11］.水解度的计算公式为DH=VNaOH·1/α·cNaOH/Mp·1/htot.式中，VNaOH(mL)为水解过程中消耗的NaOH量;Mp(g)为蛋白总量;α为α-氨基的解离度，α=10pH－pK/(1+10pH－pK)，其中pK为α-氨基的pK值;cNaOH为摩尔浓度;htot为每克蛋白质中肽键的当量数，取为8.38.1.2.6 鹿茸肽粗提液的制备取适量新鲜鹿茸，加入一定体积的水，用4 mol/L的NaOH溶液调节反应体系pH=8.0，于50℃恒温水浴振荡反应.将预先50℃保温的酶液加入到上述体系中，开始酶解反应.在反应过程中，通过补充0.5 mol/L的NaOH来维持反应体系pH值为8.0±0.1.根据加入的碱量计算水解度，预期水解度达到10%时，加入2 mol/L的HCl调节pH为4.0，于90℃保温10 min使酶灭活.终止反应，将水解液冷却至常温，于4℃下以10000 r/min高速离心浓缩20 min，减压抽滤过0.45 μm滤膜3次，收集滤液，即得鹿茸肽粗提液.1.2.7 鹿茸肽粗提液的分离纯化 (1)硫酸铵分级沉淀［10］:对鹿茸肽粗提液采用硫酸铵分级法进行初步分离.(2)凝胶过滤层析:取鹿茸粗提液冻干品用Sephadex G-25凝胶过滤柱进行分离纯化，分别收集各洗脱峰，真空冷冻干燥.用于抗氧化活性试验筛选.(3)制备型HPLC纯化:取适量Sephadex G-25凝胶过滤得到的抗氧化活性最强的组分，用制备型HPLC进一步纯化.收集样品，进行抗氧化对比实验.采用Folin-酚法测定酶解鹿茸肽的蛋白含量［12］;氨基酸组成分析采用反相色谱分离方法进行［13］;分子量鉴定采用电喷雾质谱(1100 LC/MS)测定.1.4.1 O2－自由基清除实验利用邻苯三酚(PR)自氧化法测定酶解鹿茸肽清除O2－自由基的抗氧化性［14～16］.酶解鹿茸肽对邻苯三酚自氧化抑制率采用下式计算:I(%)=(ΔA0－ΔA)/ΔA0×100%，其中I为抑制率，ΔA为加入肽液后邻苯三酚的自氧化速率，ΔA0为加入肽液前邻苯三酚自氧化速率，自氧化速率定义为每分钟光密度值的变化.1.4.2 羟自由基清除实验采用Fe2+-H2O2-罗丹明分析体系检测酶解鹿茸肽对羟自由基清除能力［17］.鹿茸肽对羟自由基的清除率(D)的计算公式如下:D(%)=(As －A0)/(A－A0)×100%.式中As为加入一定量的抗氧化药后体系的吸光度，A0为未加抗氧化药的体系的吸光度，A为未加Fenton试剂及抗氧化药的体系的吸光度为.1.4.3 脂质过氧化实验参照文献［18］中的硫氰酸铁法进行脂质过氧化实验.1.4.4 还原力测定取0.25 mL鹿茸肽溶液，加入0.25 mL 0.2 mol/L pH=6.6的PBS缓冲液及0.25 mL 1%铁氰化钾，置于50℃水浴中20 min.取出冷却到室温后，加入0.25 mL 10%三氯乙酸(TCA).于4℃下，以3000 r/min转速离心10 min.取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸馏水及0.1 mL 0.1%三氯化铁溶液，反应10 min.在700 nm下测定其光吸收值，吸光值的高低表示样品的还原能力的强弱.2.1.1 水分含量测定测定结果表明，新鲜梅花鹿鹿茸样品中水分含量为81.94%.2.1.2 总氮量和蛋白含量测定微量凯氏定氮法测得鹿茸总氮量平均值为10.25%，鹿茸蛋白含量平均值为64.1%.2.1.3 酶解鹿茸肽的分离和纯化在正交试验所确定的最佳酶解条件下制备得到的鹿茸肽粗提物为淡黄白色粉末.经Sephadex G-25凝胶色谱柱分离，共获得3个洗脱峰(VAP-A，VAP-B和VAP-C)，经抗氧化实验检测发现，鹿茸多肽B(VAP-B)组分的活性明显高于VAP-A和VAP-C组分.VAP-B组分冻干后，呈淡黄白色粉末状.将层析分离得到的VAP-B组分用制备型HPLC柱进行进一步的分离纯化.收集各洗脱峰，进行抗氧化实验，结果发现，第一个洗脱峰(VAP-B1，保留时间为2.182 min)活性较强.经透析、冻干后，得到的冻干品呈白色絮状干粉.2.2.1 鹿茸多肽的双缩脲反应鹿茸多肽VAP-B和VAP-B1与双缩脲试剂反应体系均呈现紫色，说明提取物中含有肽键，证明提取物是多肽或蛋白质类物质.2.2.2 Folin-酚测定蛋白质含量 HPLC纯化得到的鹿茸肽干粉蛋白含量为70.45%(质量分数).2.2.3 鹿茸肽氨基酸组成鹿茸肽VAP-B1的氨基酸分析结果如表1所示.可见，甘氨酸(Gly)和谷氨酸(Glu)含量较高.2.2.4 鹿茸肽的分子量对制备型HPLC纯化得到的鹿茸肽VAP-B1进行质谱分析，证实其为相对分子量小于800的小肽.2.3.1 对O2－自由基清除作用氧阴离子自由基具有重要的生理作用，与多种疾病的发生密切相关.氧阴离子自由基是所有氧自由基中的第一个自由基，可以经过一系列反应生成其它氧自由基，因此对其进行检测具有特别重要的意义.邻苯三酚自氧化法是检测O2－自由基的一种简便快捷的方法.邻苯三酚自氧化过程中产生O2－自由基，其自氧化产物在325 nm处有最大吸收.在抗氧化肽存在下，自氧化反应受到抑制，自氧化产物生成量减少，可通过检测325 nm下的吸收来反映抗氧化剂对邻苯三酚自氧化的抑制程度［14～16］.在本研究中，首先检测了鹿茸多肽的抗氧化效果以及对氧自由基的清除效果.实验中将鹿茸肽粗提取样品过Sephadex G-25凝胶柱后收集得到3个组分，其中第二个峰VAP-B为主峰，经进一步色谱分离纯化得到VAP-B1.VAP-B1对O2－自由基清除的效果显著，实验结果见表2.以O2－自由基清除实验结果作为评价标准，确定鹿茸肽正交水解实验结果最佳水解体系如下:酶与底物质量比1∶150，底物与溶剂质量比1∶13，水解时间90 min.考虑到60 min水解产物的抗氧化效果与90 min水解产物接近，为节约时间，后续实验采用60 min为水解时间.利用优化的实验条件水解鹿茸多肽并进行纯化，研究其清除超氧阴离子的能力.以时间为横坐标，以325 nm下吸光度值为纵坐标做图，所得直线的斜率反映了邻苯三酚的自氧化速率(图1).研究发现，在0～20 mg/mL浓度范围内，鹿茸肽的抗氧化效果呈现明显的剂量依赖性，当鹿茸肽浓度为20 mg/mL时，对邻苯三酚自抑制率可达到91.9%，表明鹿茸肽有明显的清除超氧阴离子的作用.2.3.2 对羟自由基的清除作用羟自由基是已知的最强氧化剂，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性强，是氧气的三电子还原产物，反应性极强，寿命极短，在水溶液中的寿命仅为10－6s.羟自由基几乎可以和所有细胞成分发生反应，对机体危害极大［19］.通过Fenton反应产生羟基自由基，加入显色剂罗丹明B，羟基自由基可以使罗丹明B 颜色减弱，通过在400～700 nm下测定其最大吸收波长，可间接测定羟基自由基的产生量.该法是一种简便的筛选抗氧化剂的方法［17］.同样，以分离纯化得到的水解产物VAP-B1为研究对象，研究其对羟基自由基的清除作用，结果如表3所示.最佳水解条件为酶与底物质量比1∶150，底物与溶剂质量比1∶13，时间为60 min.实验结果表明，VAP-B1对羟基自由基的清除作用达到100%，能完全清除羟基自由基.2.3.3 抗脂质过氧化作用在生物体系中，细胞膜和细胞器膜中含有大量不饱和脂肪酸侧链，很容易引起脂质过氧化，而很多疾病及衰老现象均与脂质过氧化有关.实验采用硫酸氰铁法检测了鹿茸肽的抗脂质过氧化能力.利用了脂类自由基的氧化性，可以将Fe2+氧化成Fe3+，形成硫酸氰铁化合物，利用其在一定波长吸光度值的大小反映了脂质过氧化程度的强弱［18］.鹿茸肽VAP-B1抗脂质过氧化作用的实验结果如图2所示，以维生素C为阳性对照，水为阴性对照，样品VAP-B1和维生素C的浓度均为10 mg/mL.可以看出，随着时间的增加，吸光度值都有不同程度的增大，其中阴性对照空白水的增幅最大，维生素C增幅最小，而鹿茸肽的曲线在两者之间，说明鹿茸肽VAP-B1具有一定的防止脂质过氧化作用，但抗氧化能力不及Vc.2.3.4 还原力试验样品的抗氧化作用与还原力关系密切，且吸光值越大，还原力越强.鹿茸肽还原力的测定结果如图3所示.可见，对于鹿茸肽样品而言，随着样品浓度的增大，其还原力也逐渐加强，当VAP-B1浓度为10 mg/mL时，其还原力可达到0.5左右，但明显低于对照品Vc的还原力0.8，说明鹿茸肽VAP-B1具有一定的还原力，但其还原能力低于Vc.通过酶解新鲜鹿茸获得的鹿茸多肽具有抗氧化活性，可清除体内过多的氧自由基以达到延缓衰老的作用.以抗氧化活性为指标，对酶解反应体系进行了正交优化，最佳水解条件为酶与底物的质量比1∶150，底物与溶剂的质量比1∶13，水解时间60 min.水解提取物经过一系列的纯化分离，得到的小肽分子的分子量低于800，在清除超氧阴离子、羟自由基以及抗脂质过氧化方面都表现出一定的活性.这为进一步深入研究鹿茸的抗氧化机理以及鹿茸的深加工及筛选，开发延缓衰老、耐缺氧和抗疲劳等鹿茸多肽药物提供了理论和实验依据.KeywordsVelvet antlers peptide;Alcalse;Enzymatic hydrolysis;Antioxidative activity【相关文献】［1］ HUO Yu-Shu(霍玉书)，HUO Hong(霍虹)，Winters W.D..Traditional Chinese Drug Research＆Clinical Pharmacology(中药新药与临床药理)［J］，1997，8(2):79—81［2］ FAN Yu-Lin(范玉林)，XING Zeng-Tao(邢增涛)，WEI Gong-Qing(卫功庆)，LIU Gui-Rong(刘桂荣)，LI Hui-Ping(李慧萍)，ZHOU Shu-Qin(周淑琴).Journal of Economic Animal(经济动物学报)［J］，1998，2(1):27—31［3］ DING Chang-Hai(丁长海)，WU Cheng-Yi(吴成义)，WEI Wei(魏伟)，SHEN Yu-Xian(沈玉先)，ZHOU Ai-Wu(周爱武)，JIN Yong(金涌)，HAO Ji-Qing(郝吉庆)，XU Shu-Yun(徐叔云).Acta Universitatis Medicinalis Anhui(安徽医科大学学报)［J］，1995，30(1):4—6［4］ ZHOU Qiu-Li(周秋丽)，GUO Ying-Jie(郭颖杰)，WANG Li-Juan(王丽娟)，WANGYing(王颖)，LIU Yong-Qiang(刘永强)，WANG Yan(王岩)，WANG Ben-Xiang(王本祥).Acta Pharmacologica Sinica(中国药理学报)［J］，1999，20(3):279—282［5］ GUO Ying-Jie(郭颖杰)，ZHOU Qiu-Li(周秋丽)，LIU Ping(刘平)，WANG Ying(王颖)，FANG Jin-Rong(房金荣)，WANG Ben-Xiang(王本祥).Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics(中国生化药物杂志)［J］，1998，19(2):74—76［6］ WENG Liang(翁梁)，ZHOU Qiu-Li(周秋丽)，WANG Li-Juan(王丽娟)，LIU Yong-Qiang(刘永强)，WANG Yan(王岩)，WANG Ying(王颖)，WANG Ben-Xiang(王本祥).Acta Pharmaceutica Sinica(药学学报)［J］，2001，36(11):817—820［7］ YANG Lu-Lu(杨璐璐)，CHI Cheng(迟程)，QIN Fei(秦非)，CHI Ping(迟萍).Journal of Yunnan College of Traditional Chinese Medicine(云南中医学院学报)［J］，1995，18(4):19—23［8］ CHEN Shu-Ming(陈书明)，NIE Xiang-Ting(聂向庭).Laboratory Animal Science and Administration(实验动物科学与管理)［J］，2000，17(1):22—24［9］ HUANG Wei-Kun(黄伟坤).Food Inspection and Analysis(食品检验与分析)［M］，Beijing:China Light Industry Publication House，1989:8—10［10］ ZHANG Long-Xiang(张龙翔)，ZHANG Ting-Fang(张廷芳)，LI Ling-Yuan(李令媛).Biochemical Experimental Methods and Technology，2nd Edition(生化实验方法和技术，第二版)［M］，Beijing:High Education Publication House，1997:47—51，136［11］ LU Jian(陆健).Purification Technology and Application of Protein(蛋白质纯化技术及应用)［M］，Beijing:Chemical Industry Publica-tion House，2005:29—52［12］ Lowry O.H.，Rosebrough N.J.，Farr A.L.，Randall R.J..J.Biol.Chem.［J］，1951，193:265—275［13］ ZHANG Yu-Kui(张玉奎).Modern Methods of Isolation and Analysis for Biological Samples(现代生物样品分离分析方法)［M］，Beijing:Science Publication House，2003:50—55［14］ LI Yong-Li(李永利)，ZHANG Yan(张焱).Chinese Journal of Health Laboratory Technology(中国卫生检验杂志)［J］，2000，10(6): 673［15］ ZHANG Hong(张宏)，TAN Zhu-Jun(谭竹钧).Acta Scientiarum NaturaliumUniversitatis Neimongol(内蒙古大学学报，自然科学版)［J］，2002，33(6):677—681 ［16］ ZHANG Yan-Rong(张艳荣)，WANG Da-Wei(王大为)，ZHANG Ya-Yuan(张雅媛)，LIU Ting-Ting(刘婷婷)，LI Yu-Ji(李玉姬).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)［J］，2009，30(2):293—296［17］ FANG Guang-Rong(方光荣)，LIU Jie(刘洁)，SONG Gong-Wu(宋功武).Chinese Journal of Analysis Laboratory(分析试验室)［J］，2004，23(10):55—57［18］ Shimada K.，Fujikawa K.，Yahara K.，Nakamura T..Journal of Agricultural and Food Chemistry［J］，1992，40:945—948［19］ LI Huan-Min(李唤民)，GAO Nan(高楠)，LIU Lei(刘磊)，SHEN Si-Le(申斯乐)，LUO Gui-Min(罗贵民).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)［J］，2009，30(7):1353—1356AbstractAn industrial alkaline protease alcalase was used to hydrolyze the fresh velvet antler of sika deer (Cervus Nippon Temminck).The conditions of enzymatic hydrolysis were optimized.The effects of several factors，including amount of the enzyme，substrate concentration and hydrolysis time，on the antioxidative activities of the hydrolysis product were examined by orthogonal test design.The optimum hydrolysis conditions were established to be the amount of enzyme，1∶150;the substrate concentration，1∶13;hydrolysis time，60 min.The crude velvet antlers peptides were prepared by fractionation of ammonium sulphate.An elution peak with high antioxidative activities from Sephadex G-25 column chromatography of the crude velvet antlers peptides was collected and named as VAP-B.Finally，a further purified velvet antlers peptide component(VAPB1)with molecular weight distribution from 200 to 800 was obtained from VAP-B by preparative HPLC.The protein content of VAP-B1was 70.45%.An analysis of amino acid composition was also carried out.The antioxidative activities of velvet antlers peptide component(VAP-B1)，including removal of superoxide anions，hydroxyl radicals and inhibition of lipid peroxidation were examined.The reducing power of VAP-B1was also tested.The experimental results indicated that when VAP-B1concentration was 20 mg/mL，the inhibition ratio to pyrogallic acid autoxidation reached to 91.9%，having a strong ability to scavenge superoxide anion;when VAP-B1concentration was 10 mg/mL，the clearance rate to hydroxyl radical was 100%and was dosagedependent in a certain rage of concentration.At the same time，VAP-B1showed some capability of inhibition of lipid peroxidation and reducing power.。

党发〔2009〕6号院发〔2009〕12号关于印发《吉林大学中日联谊医院科主任、护士长及科级干部聘任工作实施细则》的通知各科室：为做好吉林大学中日联谊医院科主任、护士长及科级干部聘任工作，根据吉林大学《关于开展临床医学院科主任、护士长及科级干部聘用工作的通知》（校人字〔2009〕8号）等有关文件精神，结合我院岗位设置工作需要，经院党政联席会议研究决定，制定本实施细则。

现予以印发，请认真遵照执行。

附件：《吉林大学中日联谊医院科主任、护士长及科级干部聘任工作实施细则》二○○九年三月二十五日附件：吉林大学中日联谊医院科主任、护士长及科级干部聘任工作实施细则根据吉林大学《关于开展临床医学院科主任、护士长及科级干部聘用工作的通知》（校人字〔2009〕8号）等有关文件精神，结合我院岗位设置工作需要，经院党政联席会议研究决定，制定本实施细则。

一、聘任工作的原则（一）党管干部的原则；（二）任人唯贤的原则；（三）注重实绩的原则；（四）公开、平等、竞争、择优的原则；（五）民主集中制的原则；（六）依法办事的原则。

二、聘任范围凡符合本次聘任资格和条件的校内在编在岗人员，均可申报此次公布的岗位。

本次聘任，按照竞聘上岗的程序和办法进行。

人事科、财务科、供应科、药剂科、后勤中心、科教科正职原则上轮岗。

根据院党政联席会议研究，决定设立总会计师岗位（正科级）。

三、聘任的条件和资格（一）聘任条件具有一定的政策及理论水平，拥护党的路线、方针、政策，具有较好的政治素质和思想品德；有一定的组织领导能力，具有相应的专业知识和一定的工作经验；身体健康、爱岗敬业、团结同志、公道正派、坚持原则、廉洁奉公。

（二）聘任资格1、科主任聘任资格（1）原则上应具有高级专业技术职务。

（2）续聘科主任，年龄应未满56周岁（1953年2月25日以后出生）；新聘科主任，年龄应未满50周岁（1959年2月25日以后出生）。

新聘副主任，年龄应未满45周岁（1964年2月25日以后出生）（3）新聘副主任，对于具有博士学位、有一年以上出国留学经历、工作能力强、表现突出者，可适当放宽聘任条件。

讲座文章编号：1005-2208（2012）05-0409-03喉返神经监测技术原理与临床应用刘晓莉，孙辉中图分类号：R6文献标志码：A【关键词】术中神经监测；喉返神经Keywords intraoperative neuromonitoring；recurrent laryngeal nerve喉返神经损伤是甲状腺手术最严重的并发症，导致病人生活质量下降甚至危及生命。

如何规避喉返神经损伤，一直是外科医生探索的课题。

甲状腺术中常规识别喉返神经是喉返神经保护的金标准。

但即使外科操作标准化，国内文献报道喉返神经损伤发生率0.3%~18.9%［1］，仍然较高，而且不同医生间差别较大。

近年来，术中神经监测（in-traoperative neuromonitoring，IONM）在欧美国家广泛使用，术中快速定位喉返神经，甄别解剖变异，特别是在复杂甲状腺手术中提示风险操作，降低神经损伤率，成为喉返神经保护的有效辅助手段。

本文将对此项技术的原理及临床应用做一阐述。

1喉返神经监测的技术原理1.1常规监测原理喉返神经监测技术原理（图1），基于喉返神经含有运动神经纤维，在术中应用探针（A）直接刺激喉返神经，喉返神经传递电刺激，使支配声带肌产生肌电信号，通过气管导管表面与声带接触的电极（B）接受肌电信号，神经监测仪显示肌电波形并发出提示音（C）。

如探测点至神经支配肌肉端功能完整，可引起声带肌电反应；喉返神经受损，声带肌电信号明显减弱，通过分析声带肌电信号波形、波幅、潜伏期变化，监测神经功能状态。

部分肌电信号消失也可能归咎于设备连接失误［2］。

喉返神经损伤点远端，仍能与声带肌、外围监测系统形成电生理环路，产生肌电信号；而损伤点近端探测时，电流无法跨越神经损伤点，导致支配肌肉接收不到电流刺激，无法诱导肌电信号。

根据以上表现，定位肌电信号发生变化的位置，即为神经损伤点。

限定神经损伤位置，便于快速查找分析损伤原因，及时处理喉返神经损伤。

甲状腺显示胸腺样分化癌1例报道胡章;于天宇;庞润明;张景;张纯海【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】2页(P134-135)【作者】胡章;于天宇;庞润明;张景;张纯海【作者单位】吉林大学中日联谊医院甲状腺外科，吉林省外科转化医学重点实验室，吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院甲状腺外科，吉林省外科转化医学重点实验室，吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院甲状腺外科，吉林省外科转化医学重点实验室，吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院甲状腺外科，吉林省外科转化医学重点实验室，吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院甲状腺外科，吉林省外科转化医学重点实验室，吉林长春 130033【正文语种】中文患者，女性，41岁，因“发现甲状腺肿物1年”于2014-5-28日入院，不伴心悸、气短、多食、易怒、声音嘶哑、呼吸困难、饮水呛咳。

甲状腺功能检查未见异常。

专科查体：胸骨上窝偏右可触及一无痛性肿物，大小约3 cm×2 cm，活动性欠佳，质地硬。

颈部超声(图1)：甲状腺左叶中下部可见大小0.90 cm×0.94 cm低回声，边界不清，边缘血流丰富，紧邻其下方浅层可见大小0.24 cm×0.25 cm低回声，边界模糊不清，内见少许血流。

峡部可见大小3.19 cm×1.90 cm低回声，边界模糊不清，内血流较丰富。

右叶上部深层可见大小0.43 cm×0.20 cm类囊性回声，边界尚清，内无血流。

右叶中部可见长径0.17 cm类囊性回声，内无血流。

右叶中部可见大小0.73 cm×0.70 cm低回声，边界模糊不清，内见少许血流。

颈部CT(图2)：甲状腺双侧叶内可见多发斑片低密度灶，左侧叶为著，边界不清，密度不均；胸骨上窝气管前见类椭圆形软组织密度影，大小约3.2×1.7 cm，边缘欠清。

万方数据・－－——７８８・－－——敏有关的病例６３例，对其喉、肺、胃、肠组织进行肥大细胞甲苯胺蓝的染色，本研究参照甲苯胺蓝常规染色［４］为基础，采用甲苯胺蓝染色的改良方法［５Ｊ５，即肥大细胞经过甲苯胺蓝染色后不经过水洗，直接用丙酮脱水，然后用二甲苯透明。

并对６３例心脏血液测定１ｒＥ水平。

２结果过敏性休克的病理诊断依据：在排除其他致死性原因的基础上，死者的胃、肠粘膜和粘膜下层浸润的嗜酸粒细胞增多，特别是喉和气管粘膜与粘膜下层。

甲苯胺兰染色的肥大细胞成行，成群或者单个存在于上述组织内和常成堆或单个分布于血管附近。

细胞呈圆形或卵圆形，核小，染色浅，位于细胞中央，细胞质中充满大小一致、具有异染性的嗜碱性颗粒，均匀分布在核周围（图ｌ肥大细胞）。

肥大细胞中的含有的颗粒，从崩解的细胞中释放出来，为脱颗粒现象（图２肥大细胞脱颗粒）具有诊断意义。

诊断为过敏性休克的６３例死者生前感觉一般状况尚可，外显症状不明显，在输液体过程中或输液后３小时内突然感觉胸闷气急、呼吸困难死亡。

尸检检测在喉、气管等部位见到明确的肥大细胞脱颗粒现象，确证为过敏的为２５例，占输液体过程中或输液后３小时内急死病例的３９．７％，死者生前所输用的药物，包括利多卡因、青霉素、双黄莲、青开灵、安痛定等。

其余的３８例病例患者死于主动脉夹层动脉瘤破裂７例、心功能不全２ｌ例、肥厚性心肌病６例、糖尿病引起高血压４例，占输液体过程中或输液后３小时内急死病例的６０．３％。

图１肥大细胞（２００×）在６３例输液体过程中或输液后３小时内急死病例的心脏血ＩｇＥ检验值分布在０—４８．８ＩＩＪ／ｌＩｌｌ之间，均小于Ｉ临床判定过敏反应的参考值（血清Ｉ班的参考值为小于１００ＩＵ／ｍｌ，大于１００ＩＵ／ｍｌ可考虑过敏）。

图２肥大细胞脱颗粒（４００ｘ）３讨论在常规的ＨＥ染色切片中，很难辨认出肥大细胞，更无法观察其脱颗粒现象的有无，因此仅凭ＨＥ染色不能对过敏作出准确的诊断。

附件：
2011年拟选留毕业生体检合格人员名单
一、教师编制
孔晨飞李鑫朱丽君纪铁凤张展
二、医生系列
杨景慧佟玲玲陈冰宋旸袁宝明付庆锋王雪王胜群魏鑫王展鹏张琳李清春许猛高键薛锦儒赵丽华范春妮池国男赵健沈可欣董晓明高永建李世杰王云芸谢丽娟王晓楠田耕任梁前垒于天宇沙骥超秦瑞高琛茂王堃赵亚男崔娜康明阳王冠郭佳秦少游张芝平童亚良邢云龙赵亚男张旭李洋付宇倪梓元马国芳晁阳康春阳王月英于莉莉韩莹莹郭锋张青玲王欣李东霓张尔驰于杉苏美华张涛宫立程连德德张乐宁钟专孙鸿燕宋丽娜丁梦张妍时景伟盛世厚
三、医技编制
王震李新宇
四、药剂编制
尹航王颖王惠媛
五、护理编制
潘冬雪杨萍崔海玲刘威赵丹赵双艳王嫣艳杨淑淇王莹李竹官郑微张颖陈琳孙语悦王新昕于贺徐美雯田蕾蕾谢虹菲张吴奇夏英婉杨会鲁博爱周伯良门华一
六．财会编制
国诗佳于典鹭李吉杨琪刘明达王舒阳陈光。