2011-2012学年第一学期《蛋白质工程和酶工程》复习题1.易错PCR和DNA搅乱重组原理。
易错PCR 是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。
DNA搅乱重组是指在PCR过程中利用某些因不具有3′-5′校读功能的DNA 聚合酶（如Taq 酶）导致产生很低概率的随机碱基错配的缺陷建立的一项蛋白质分子体外快速进化新技术，称为DNA Shufflin又译为DNA搅乱重排和DNA“洗牌”。
首先利用DNA 聚合酶的错配进行错误导向PCR 产生随机突变子库,然后打断、搅乱和重组以获得带有多点突变的全长基因(这一步可以反复进行多次) ,下一步是扩增和克隆带有多点突变的基因,最后是筛选期望的重组子。
2.X射线和圆二色谱测定蛋白质三维结构的原理。
（题目改过，删除原来第三题）X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象，而X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。
当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。
衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。
圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。
生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构。
圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。
3.表达载体的基本构成元件有哪些？启动子、终止子、核糖体结合位点、翻译起始密码子、终止密码子。
4.测定蛋白质空间结构的主要方法有哪些？X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱法（NMR）、电镜三维重构法、各种光谱技术（如圆二色谱法）、显微技术和计算机模拟。
5.常见的氢键发生在哪些基团间？答：氨基酸残基的N－H与氨基酸残基的C=O形成的。
6.常用的蛋白质表达系统及优缺点。
答：大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统和哺乳动物表达系统。
1、大肠杆菌表达系统：优点：细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低。
缺点：缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏。
2、酵母表达系统：优点：增殖快、操作简单、成本低等，可如真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰。
缺点：它的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。
3、杆状病毒表达系统：优点：种族蛋白质具有完整的生物学功能，能进行翻译后的加工修饰（糖基化、磷酸化、酰基化等）；表达水平高，能容乃大分子的插入片段（约10kb）；可以表达多个基因，并且适合表达细胞毒性蛋白，表达的蛋白安全。
缺点：为非连续表达，产物糖基化相对简单。
4、哺乳动物表达系统：优点：哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。
缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高。
7、带苯环的芳香族氨基酸有哪些？答：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
8、蛋白质的变性与复性。
（秋艳）答：蛋白质变性：天然蛋白质因受到物理和化学的因素影响，使蛋白质严格的空间结构受到破坏，（但不包括肽键的裂解），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质变性作用。
蛋白质复性：变性的蛋白质恢复其天然活性的现象称为复性。
9、蛋白质的常用染色方法有哪些，各自优缺点？答：考马斯亮蓝、银染、荧光染色、负染。
1、考马斯亮蓝优点：考马斯亮蓝检测范围30-100ng，染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。
缺点：灵敏度较低，胶体考马斯亮蓝染色的检测灵敏度为8-10ng，但染色时间较长（24-48小时），染色过程给下游质谱检测带来较多不便。
2、银染优点：灵敏度高，可达到200pg，快速银染可与下游质谱兼容。
缺点：线性很差。
普通的银染过程中因醛类的特异性反应，与下游质谱不兼容。
快速银染检测灵敏度低，伴有很深的背景干扰。
3、荧光染料优点：灵敏度高，线性程度好，对质谱干扰小。
缺点：成本高。
4、负染优点：能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，染色速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。
缺点：不能用于膜上染色。
10、蛋白质分子设计的分类？答：1、定点突变或化学修饰法2．拼接组装设计法3．从头设计全新蛋白质11、蛋白质分子设计的一般程序。
答：1、收集相关蛋白质的结构信息。
2、建立所研究蛋白质的结构基础。
3、结构模型的生物信息分析。
4、选择设计目标5、序列设计。
6、预测结果。
7、获得新蛋白质8、新蛋白质的检验9、完成新蛋白的测定。
12.蛋白质免疫印迹。
蛋白质免疫印迹主要包括三个步骤：第一步是凝胶电泳；第二步是转膜，把凝胶上的蛋白质条带转移固定到薄膜上；第三步是抗原抗体显色反应。
13.蛋白质提取的粗分级和细分级方法各有哪些。
蛋白质粗分级方法包括硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超滤、蛋白质结晶等。
蛋白质细分级方法包括分子筛层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等多种层析和电泳。
14.蛋白质组学研究的现代技术主要有哪些。
双向电泳技术（2DE），计算机图像分析与大规模数据处理技术，质谱技术(MS)。
老师指导：如果是论述题要进行相应的阐述。
（主观题分简答和论述）15.蛋白质组与蛋白质组学的概念。
蛋白质组(proteome) ：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质。
蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译修饰、蛋白质功能确定、蛋白质与疾病的关系、蛋白质相互作用。
16.第二遗传密码。
氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码。
第二遗传密码具有简并性、多义性、全局性和复杂性等特点。
17.多肽链。
通过肽键将多个氨基酸连接在一起构成多肽链。
18、二硫键的主要作用二硫键(共价键)为了确定蛋白质的一级结构，须在2-巯基乙醇、二硫苏糖类、巯基乙酸等硫化合物与尿素等变性剂同时存在下将二硫键打开。
RNA酶复性实验发现二硫键对肽链的正确折叠不是必要的，但它对稳定折叠态结构作出贡献。
（对稳定蛋白质的空间结构，保持和调节其活性有非常重要作用。
）19、分子伴侣定义及其功能？（有老师建议）定义：分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。
（一组从细菌到人广泛存在的蛋白质，非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助它们折叠和转运，通常不参与靶蛋白的生理功能。
）分子伴侣的功能：(1)可调节性地阻碍多肽链集聚(2)具有折叠互补功能,即可使已形成的蛋白质集聚体重折叠和恢复其水溶性(3)可以促进折叠错误的蛋白质降解另一答案：分子伴侣(molecular chaperone)：是进化上十分保守的蛋白质家族，广泛存在于多种生物体内，其主要作用是与新生肽或部分折叠的蛋白质的疏水表面结合，加速其折叠或组装成天然构象的进程，并防止其相互聚集和错误折叠老师建议：只要回答到：“细胞内一类保守蛋白质，促进各功能域（或新生肽）和整体蛋白质的正确折叠。
”都给分。
20、何谓蛋白工程。
蛋白质工程：以蛋白质的结构和功能为基础，通过基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术。
21、何谓蛋白质的结构域。
结构域(domain) ：是在超二级结构基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球状的结构。
在空间上彼此分隔，各自具有部分生物功能的结构。
22、何谓定点突变与定向进化，各有哪些常用方法。
蛋白质工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。
定点突变是依据酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点来引入变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
体外定向进化是在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能。
定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。
该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。
几种寡核苷酸介导的基因突变方法：①Kunkel 突变法②基于抗生素抗性“回复”的突变方法③基于去除特定限制酶切位点的突变酶的定向进化(Directed Evolution)在不需事先了解酶的空间结构和催化机制的条件下，通过各种突变方法向编码生物催化剂的基因中引入突变，突变的基因可以通过重组如DNA改组等方法进行重新组装，利用这些重组方法可以提高基因进化的效率。
蛋白质的体外分子定向进化：易错PCR（Error prone PCR）和DNA 搅乱重组（DNA shuffling）。
23、何谓内含肽，有何应用价值。
蛋白质内含肽：在蛋白质成熟过程中被剪切掉的一段框内融合于前体蛋白的氨基酸序列。
可以催化自身从蛋白质前体中断裂，使两侧的蛋白质外显肽连接成成熟的蛋白质。
内含肽的应用：1、利用内含肽载体致力生物合成C-S酯键肽链或N-半胱氨酸肽链2、内含肽介导的异源蛋白质体外连接3、用反式剪切技术实现蛋白质体内、体外连接4、双内含肽介导的蛋白质自身环化及蛋白多聚体的生成24.核磁共振的原理、特点有哪些。
答：核磁共振的原理是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。
特点是：可以在水溶液或有机相中研究生物大分子结构，研究溶液条件的改变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内部动力学的特点；但是分辨率不高。
目前，核磁共振只能用于测定小分子和中型蛋白质的结构25.肌红蛋白的结构与功能。
答：肌红蛋白是哺乳动物的肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。
肌红蛋白是由一条多肽链和一个辅基血红素构成，相对分子质量16700，含有153个氨基酸残基。
在肌红蛋白中，作为辅基的血红素非共价的结合在肌红蛋白的疏水空穴中，通过配位键与肽链中的93位氨基酸残基结合，这对肌红蛋白的天然构像的形成与稳定起到了显著的效应。
