第六章 酶的修饰与分子定向

六、定点突变的局限性
• 定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数 的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级 结构基本维持不变，因而对酶功能的改 造较为有限。同时，由于已有的结构与 功能相互关系的信息远远不能满足当今 人们对蛋白质新功能的要求。
第三节 酶分子的定向进化
• 酶的体外定向进化属于蛋白质的非理性设计。
O2N pH>7 E-NH2+SO3H O2N NO2 E HN O2N NO2 O2N
（3）酶的亲和修饰
• 酶的位点专一性修饰是根据酶和底物的 亲和性，修饰剂不仅具有对被作用基团
的专一性，而且具有对被作用部位的专
一性，这类修饰剂称为位点专一性修饰 制剂。 • 亲和试剂一般是酶的底物（或配体）的 类似物。
• 它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通
过人为地创造特殊条件，模拟自然进化机制， 以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方 法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非 天然酶，短期内可以在试管中完成自然界需要 几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶 和新的生理生化反应的重要途径。
一、定向进化的原理
（3）常用修饰剂
酰化试剂：如琥珀酸酐对氨基的修饰
烷化剂：如碘乙酸对巯基的修饰 形成酯和酰胺的试剂：如用甲醇/盐酸对 羟基的修饰 氧化还原试剂：如巯基乙醇对二硫键的 修饰（还原反应）
2，方 法
酶蛋白侧链的修饰
– – – – – – – – 羧基的化学修饰 氨基的化学修饰 精氨酸胍基的修饰 半胱氨酸巯基的化学修饰 组氨酸咪唑基的修饰 色氨酸吲哚基的修饰 酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰 甲硫氨酸甲硫基的修饰
二、化学修饰的目的
增强酶天然构象的稳定性减少酶热失活 保护酶活性部位与抗抑制剂 维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶 消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
三、原 理
• 充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的 特性，或直接或经过一定的活化过程与酶 分子上某种氨基酸残基产生化学反应，对 酶分子结构进行改造。
5,PCR扩增突变法
将待突变的靶基因克隆在一个载体 质粒上，重组分子分在含有两种不 同引物的反应管A和B中。
将A、B两管的扩增产物混合变性并 退火，只有I-III和II-IV杂合双链呈 交叉缺口的环状结构且含有突变位 点，这种分子不经连接可直接转化 大肠杆菌，而其它组合形式的杂合 双链则为线型分子，通常难以形成 克隆。
三、定向进化的方法
易错PCR（error-prone PCR） DNA改组（DNA shuffling）
Family shuffling
交错延伸重组STEP ( staggered extension process)
随机引物体外重组( random priming in vitrorecombination RPIR) 临时模板随机嵌合生长( random
修饰 酶 修饰部位 新氨基酸残基 酪氨酰 2TRNA 合 成酶 β -内酰胺酶 51 51 70～71 70～71 二氢叶酸还原酶 27 苏→丙 苏→脯 丝,苏→苏,丝 苏,丝→丝,丝 天冬→天胺 对底物 ATP 的亲 合力提高 100 倍 完全失活 恢复活性 活性降低为正常 酶的 0.1% 原氨基酸残基酶性质的改变
C
U
3，部分片段合成法
如果在待突变的位点上下游 含有合适的限制性内切酶识 别序列，尤其当多个待突变 位点集中分布在该区域时， 可考虑直接化学合成这一片 段，在此过程中将欲突变的 碱基设计进去，然后以此人 工合成的寡聚核苷酸片段置 换重组质粒上对应的待突变 区域，即可完成基因的定点 突变。
4，引物定点引入法
– 对修饰过程的机理获得更为清晰的认识。
第二节 基因的定点突变
一、定义
• 在DNA水平上产生多肽编码顺序的特异性改变
称为基因的定点突变，这一技术是按照实验者
事先设计突变部位，采用一系列分子生物学方 法对已知DNA序列的基因改变遗传密码，进而
获得预先设计突变的表现型蛋白质。
酶性质随着定点突变而改变
第六章 酶的修饰与定向进化
为什么要用人工方法改造酶
酶的稳定性
作用的最适条件 酶的主要动力学性质的不适应
特殊的应用领域
如何修饰酶分子？
对一个已知氨基酸组成和晶 体结构的酶分子，怎样对它
进行改造？
人工改造酶的方法
理性设计（rational design)
化学修饰 定点突变
非理性设计（irrational design）
emplates ,
RACHITT)
1，易错PCR
易错PCR(error-prone PCR)是指在扩增目的基因的同时， 向目的基因中，以一定的频率随机引入突变构建突变库， 然后选择或筛选需要的突变体。 经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续 易错PCR(sequential error-prone PCR)策略。即将一次PCR 扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连 续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产 生重要的有益突变。
二、特点
• 与传统的诱变方法相比，这种技术有如 下优点：
– 诱变部位是实验者事先设计的，突变完全在 人为控制下进行；
– 获得所需酶突变表现型比例很高，且无分离 现象；
– 生物体没有别的基因是突变的，这样该生物 所有希望保留的特性都保留了。
三、策略
1，局部随机渗入法
两个酶切位点RE1和RE2，它们分别 能产生5’和3’突出的单链粘性末端 并通过酶解反应时间控制新生成的单 链区域大小
• 修饰过程能够简便易行；
• 不引起蛋白质的不可逆变性；
• 尽可能提高修饰反应专一性。
2，反应条件控制
• 根据以上要求，反应温度、pH、反应介质和反 应物配比等都要控制在一定的范围。 – 多数情况下，在蛋白质等电点附近的pH范
围内，增加pH可以提高反应速率，降低pH
可以减小反应速率。反应活性较高的修饰剂 在中性或近中性的pH下即可以与蛋白质迅 速偶合；而反应活性较低的修饰剂则需要较 高的pH。
• 酶分子的非理性设计：不需要正确 的酶分子结构信息而通过随机突变， 基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
本章的教学内容
第一节 第二节 酶蛋白的化学修饰 基因的定点突变
第三节
酶分子的定向进化
重点掌握：酶的化学修饰、酶的定点
突变、酶的定向进化（概念和流程）
第一节 酶蛋白的化学修饰
一、定义 • 广义：凡通过化学基团的引入或除去， 使蛋白质共价结构发生变化，都可称为 蛋白质的化学修饰。 • 狭义：在分子水平上对酶进行改造，即 在体外将酶的侧链基团通过人工方法与 一些化学基团，特别是具有生物相容性 的大分子进行共价连接，从而改变酶的 酶学性质的技术称为酶蛋白的化学修饰， 也称为选择性化学修饰。
定向进化（directed evolution） 杂合进化（hybrid evolution）
• 酶分子的理性设计：利用各种生物化学、 晶体学、光谱学等方法对天然酶或其突 变体进行研究，获得酶分子特征、空间 结构、结构和功能之间的关系以及氨基 酸残基功能等方面的信息，以此为依据 对酶分子进行改造。
3，终止修饰反应的方法
• 加入某种化学试剂(通常为氨基酸)与修 饰剂反应，从而消耗掉游离的修饰剂；
• 通过洗滤、超滤或透析将修饰蛋白与未 修饰蛋白和游离的修饰剂分开； • 改变反应条件，如反应的pH值等，使修 饰反应停止。
六、酶化学修饰的应用
七、酶化学修饰的局限性
某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一
• 在待进化酶基因的PCR扩 增反应中，利用Taq DNA 多聚酶不具有 3′→ 5′校对 功能的性质，配合适当条 件，以很低的比率向目的 基因中随机引入突变，构 建突变库，凭借定向的选 择方法，选出所需性质的 优化酶(或蛋白质)，从而 排除其他突变体。
二、酶分子存在进化潜力的原因
• 天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际 应用环境不同。 • 自然选择的筛选压力与实际应用的差异。 • 某些酶待进化的性质不是其生物体内所涉 及的。
四、设计思想
• 引入二硫键以提高蛋白质的稳定性 • 转换氨基酸残基以提高蛋白质的稳定性
• 转换半胱氨酸残基以减少多肽链错误折 叠的可能性
• 提高酶的催化活性 • 消除酶的被抑制特性 • 修饰酶的催化特性
五、定点诱变技术的应用 和意义
• 利用基因定点突变技术，可以人为地通过基因 的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而 可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋 白质分子之间的相互作用。目前，利用寡聚核 苷酸定点诱变来进行酶及其他一些蛋白质的稳 定性、专一性和活性的研究，已经有很多实例。 可见，它为酶的工业化以及应用开辟了新途径。
2，反应条件控制
– 有些蛋白质属于热敏性蛋白质，修饰反应需要 在较低温度下进行。在此情形下，反应时间要 适当延长。 – 离子强度对修饰反应也会有一定程度的影响， 因此需要选择适宜的缓冲剂。其中，磷酸盐和 碳酸盐缓冲体系因为与生物体内的缓冲体系接 近而应用最多。
– 一般地，通过改变修饰剂/蛋白质的物质的量 的比和改变pH可以迅速地得到对应于特定修 饰度的实验条件。
在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，故属 于无性进化 (asexual evolution)。它较为费力、耗时，一 般适用于较小的基因片段 (< 800bp)。此外，使用该方 法易出现同型碱基转换。
四、影响蛋白质修饰化学反 应的因素
• 影响蛋白质化学修饰反应的主要因素有 两方面:
– 蛋白质功能基的反应活性；
– 修饰剂的反应活性。
• 影响蛋白质功能基反应活性的因 素可以归纳为以下几个方面：
– 微区的极性； – 基团之间的氢键效应； – 基团之间的静电效应； – 基团之间的空间阻力。
• 修饰剂的反应活性的决定因素