口蹄疫病毒致病分子机制

摘要口蹄疫是由口蹄疫病毒引起牛、羊、猪等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的世界性重大动物疫病，疫苗免疫仍然是目前以至将来防控口蹄疫的主要策略之一。

随着分子生物学的发展以及对口蹄疫病毒基因组结构与功能的深入了解，口蹄疫疫苗研究在经历了“灭活疫苗”、“弱毒疫苗”两个阶段后，已经向新型分子疫苗迈进。

而核酸疫苗基于其诸多优点，已成为口蹄疫新型分子疫苗研发的重要方向。

本实验拟将口蹄疫病毒主要免疫原基因ＶＰｌ和能非特异性增强免疫应答能力的白细胞介素一１８（ＩＬ一１８）基因，同时插入到真核表达载体，为口蹄疫新型分子疫苗研究探索新的思路。

首先从ＡｓｉａＩ型口蹄疫病毒中提取总ＲＮＡ，用特异性引物，通过反转录聚合酶链式反应获得了长度约７５０ｂｐ左右的核酸片段，将其与ｐＧＥＭ—Ｔ—Ｅａｓｙ载体连接，并转化大肠埃希氏菌ＪＭｌ０９。

重组质粒经ＰｃＲ分析和酶切鉴定以及确证性测序证明，所克隆的片段含有完整的ＶＰｌ基因：将重组质粒与表达载体ｐｃＰＮＡ３．１（＋）分别用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后连接，构建成重组表达质粒，转化宿主菌ＤＨ”经酶切及扩增鉴定筛选出阳性克隆。

测序证明，目的基因正确插入到表达载体，将它命名为ｐｃＤＮＡＶ；用同样的方法将ＩＬ－１８插入ｐｃＤＮＡＶ中，且命名为ｐｃＤＮＡＶＩ。

大量提取质粒ｐｃＤＮＡＶＩ，并将其用弗氏佐剂乳化制备成疫苗免疫３００—５００克重的豚鼠，２周后加强免疫一次，每次用ＥＬＩＳＡ检测豚鼠血清中的抗体水平。

结果表明，疫苗ｐｃＤＮＡＶＩ可引发机体产生体液免疫，且有较强的保护效果。

这将为口蹄疫基因免疫的研究提供了基础，并为从分子水平上防制口蹄疫开辟了新的途径。

关键词：口蹄疫病毒；ＡｓｉａＩ型；真核表达载体；豚鼠ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＡｓｉａＩＦＭＤＶＶＰｌＧｅｎｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒａｎｄＥｌｅｍｅｎｔａｒｙＡｎａｌｙｓｅｓｏｆＩｔｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＡｃｔｉｖｉｔｙＳｕｍｍａｒｙＦｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ（ＦＭＤＶ、ｃａｕｓｅｓａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅ——ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｎｔｈｄｉｓｅａｓｅ（ＦＭＤ）ｉｎｃｌｏｖｅｎ－ｈｏｏｆｅｄａｎｉｍａｌｓ．ＶａｃｃｉｎｅｉｓｏｎｅｏｆｍａｊｏｒｍｅｔｈｏｄｓａｇａｉｎｓｔＦＭＤｎｏｔｏｎｌｙａｔｐｒｅｓｅｎｔｂｕｔａｌｓｏｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ．ＷｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＦＭＤＶｇｅｎｏｍｅ，ＦＭＤｖａｃｃｉｎｅｈａｓｇｏｎｅ“ｉｎａｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅ”ａｎｄ“ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ”ａｎｄｈａｓａｌｒｅａｄｙｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｗａｒｄｓｎｅｗ—ｔｙｐｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｖａｃｉｎｎｅ．ＢｅｃａｕｓｅＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｈａｓｍｕｃｈｍｅｒｉｔ，ｉｔｈａｓｂｅｃｏｍｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｄｉｒｅｃｔｉｏｎｏｆｎｅｗ－ｔｙｐｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｖａｃｃｉｎｅｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ＡｓｉａＩｓｅｒｕｍＴｉｌｅｔｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｙｐｅｏｆＦＭＤＶａｎｄｔｈｅｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＶＰ１ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｂｙＲＴ－ＰＣＲ．ｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ‘ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰＣＲ．ｎｗａｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｏｎｔａｉｎｓｃｏｍｐｌｅｔｅＶＰｌｇｅｎｅｂｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＡｆｔｅｒｗａｒｄｓｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅＶＰｌｇｅｎｅｆｒｏｍｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈａｎｏｔｈｅｒｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＢａｍＨＩａｎｄＥｃｏＲＩ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨＩａｎｄＥｃｏＲＩｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｎａｍｅｄａｓｐｃＤＮＡＶｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＲａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＩＬ－１８ｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐｃＤＮＡＶｂｙｔｈｅｓａｒｎｅｍｅｔｈｏｄ，ｉｔｗａｓｎａｍｅｄｐｃＤＮＡＶＩ．ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐｃＤＮＡＶＩ，３００－４００ｇｒａｍｇｕｉｎｅａｐｉｇｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｐｃＤＮＡＶＩ，ａｎｄａｂｏｏｓｔｅｒｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗａｓｇｉｖｅｎｔｗｏｗｅｅｋｓｌａｔｅｒ．ＫｉｎｅｔｉｃｔｅｓｔｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙＥＬＩＳＡ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｈｕｍｏｒａｌｉｍｍｕｎｏｒｅｓｐｏｎｓｅｗａｓｅｌｉｃｉｔｅｄｂｙｐｃＤＮＡＶＩＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓａｎｄｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ．ＴｈｉｓｅｎｃｏｕｒａｇｅｄｆｕｒｔｈｅｒｗｏｒｋｔｏｗａｒｄｓｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＤＮＡｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＦＭＤＶａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｆｕｒＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＦＭＤＶ；ＡｓｉａＩｓｅｒｕｍｔｙｐｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；ｇｕｉｎｅａｐｉｇ２缩写ＡＡＡｍｐＡｍＤＡＭＶｂＤｃＤＮＡＤＡＢＤＥＰＣＤＮＡＤＮａｓｅｄＮＴＰＥＢＥＤＴＡＥＬＩＳＡＥＭＣＶＦＭＤＦＭＤＶｂｘ－ｇａｌ缩略词Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ英文名称ＡｍｉｎｏａｃｉｄＡｍｐｉＣｉｌｌｉｎＡｍｐｉｅｉｌｌｉｎ＋ＡｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉＳｖｉｒｕｓＢａｓｅｐａｉｒＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉＣａｅｉｄ３，３’一ｄｉａｆｆ【ｉｏｎｂｅｎｚｉｄｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＤｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅＤｅｏｘ”ｉｂｏｎｕｅｌｅｉｃａｃｉｄＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅＥｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉＣａｃｉｄＥｎｚｙｍｅ一１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉＳｒｉｍｓＦｏｏｔ——ａｎｄ——ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅＦｏｏｔ——ａｎｄ——ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓＧｌｙ（Ｇ１ｙｃｉｎｅ）５－ｂｒｏｍｏ——４——ｃｈｌｏｒｏ—、３——ｉｎｄｏｌｙｌ——ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＧＧｒａｍＧｅｎＢａｎｋＧｅｎｅＢａｎｋｈＨｏｕｒＩｇＧＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧＩＰＴＧＩｓｏｐｒｏｐｙｌ一１一ｔｈｉｏ一０一Ｄ－－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅＩＲＥＳＩｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍａｌｅｎｔｒｙｓｉｔｅｌ中文名称氨基酸氨苄青霉素产生氨苄抗性的禽成髓细胞瘤病毒碱基对互补ＤＮＡ３，３’一二氨基联苯胺焦碳酸乙二酯脱氧核糖核酸ＤＮＡ酶脱氧核营三磷酸溴化乙锭乙二胺四乙酸酶联免疫吸附测定脑心肌炎病毒口蹄疫口蹄疫病毒甘氨酸５一溴一４氯－３－，Ｊ［哚一Ｄ一半乳糖苷克核苷酸序列基因库小时免疫球蛋白Ｇ异丙基硫代一Ｂ－Ｄ一半乳苷内部核糖体进入位点ＳＤＳＴＡＥＴａｇＤＮａｓｅＴＥＴｒｌｓ—ＨＣｌＴｒｉｓＵＬＵＵＴＲＬｕｒｉａ～Ｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍ５０ｐｅｒｃｅｎｔｏｆｉｎｆｅｅｔｉｖｅｄｏｓｅＭｉＩｌｉａｍｐｅｒＭｉｎｕｔＣＭｉｌｌ儿ｉｔｅｒＭｊｌｌｉｍｏｌｅＮａｔｒｉｔｉｌｌｌａｃｅｔｉｃａａｉｄＮｕｔ／ｅｏｔｉｄｅＯｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙｏｔ６００ｎｍＯｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｎａｍｅＰｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅＰｏｌｅｍｏｌｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｃｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｐＨｖａｌｕｅＲｉｂｏｎｕｅｌｅｉｃａｃｉｄＲｉｂｏｎｕｅｌｅａｓｅＲｉｂｏｎｕｃｌｅｇｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｔＲｅｖｏｌｕｔｊｏｎｐｅｒｍｉｎｕｔｅＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｏｒｉｐｔｌＯｉｌＳｅｃｅｎｄＳｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅＴｒｉｓ／ａｃｅｔａｔｅ／（ＥＤＴＡｂｕｆｆｅｒ）Ｔｈｅｒｍｕｓ８ｑｕａｔｆｅｕｓＤＮＡ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ｂｕｆｆｅｒ）ＴｒｉＳｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅＭｉｏｒａｌｉｔｒｅＵｎｉｔＵｎｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ２ＬＢ培养基半数感染量毫安分钟毫升毫摩尔醋酸钠核苷酸６００ｎｍ吸光度开放阅读框磷酸缓冲盐水皮靡尔聚合酶链式反应ｎＨ值核糖核酸棱糖核酸酶核糖核酸酶抑自＇ＪｇＯ每分钟转数反转录反应秒十二烷基磺酸钠Ｔｒｉｓ／乙酸电泳缓冲液栖热水生菌ＤＮＡ聚合酶’ｆｒｉｓ／ＥＤＴＡ（缓冲液）Ｔｒｉ盐酸盐三（羟甲基）氨基甲烷微升单位非翻译区嵋‰．鼍㈣札蚕恍肚‰耋叫瞅州眦№咖盯１引言口蹄疫（Ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ＭｏｕｔｈＤＥｓｅａｓｅ，ＦＭＤ）是出口蹄疫病毒（Ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ＭｏｕｔｈＤｉｓｅｓｓ＠ＶＪｒｋｌｓ，ＦＭＤＶ）引起牛、羊、猪等偶蹄动物感染的一种高度接触性传染病，主要症状为口、蹄、乳头等出现水泡，水泡破裂后形成溃烂。

口蹄疫病毒在不同条件下传播因素口蹄疫（FMD）具有高度传染性，大量的口蹄疫病毒释放到环境中感染宿主而导致口蹄疫的传播并不总是可进行预测的。

在流行环境中病毒传播的特点是频繁的直接和间接的与动物接触，而口蹄疫病毒在口蹄疫无疫国家进行传播可以被视为低概率事件。

小规模的实验研究所产生的数据不能完全揭示当前口蹄疫传播的因素和特点。

本文从口蹄疫在不同易感动物之间传播的新特点，同时将病毒基因组学和流行病学的数据的进行分析来全面的了解口蹄疫传播的影响因素。

1口蹄疫的特征口蹄疫具有高度传染性，在易感家畜和野生动物中并不表现出明显的临床症状，这给口蹄疫防控带来新的挑战。

口蹄疫病毒有七种血清型，主要分布在非洲和亚洲，同时全球分布也能反映出当前贫困地区和牲畜养殖密度。

毒株变异后出现新毒株，引起连续的疫情，有时甚至会扩散到无口蹄疫地区。

用灭活疫苗进行大规模的免疫，需要考虑抗体水平维持时间较短，同时还受不同血清型和同一血清下不同的毒株影响。

在急性感染过程中，破裂的水泡、身体排泄物和脱落分泌物含有大量病毒。

易感反刍动物可通过直接接触其他急性感染动物吸入低剂量的病毒而感染。

猪经呼吸道感染口蹄疫具有一定的抵抗力，其他感染途径（如消化道或擦伤）则需要更大剂量病毒。

根据条件，口蹄疫病毒可以在环境中存活数天至数月，并可以在各种动物产品中存活。

与口蹄疫病毒清除相关的感染有快速的免疫应答，但一些反刍动物宿主存在持续感染，在特定鼻咽上皮部位及相关淋巴组织存在一定数量的病毒，成为口蹄疫病毒携带者。

感染动物之间在没有明显的流行病学联系的情况下，口蹄疫病毒侵入无口蹄疫国家经常视为低概率事件。

有个典型的例子说明口蹄疫是最具有感染性的动物疫病。

1981年在英国南部怀特岛发生口蹄疫疫情的猪场，口蹄疫病毒随着气溶胶传播到北法国海岸。

这与一般流行病或口蹄疫地方性流行的国家和地区之间的疾病循环形成对比，在这种情况下，由于易感动物之间直接接触或用于交易的动物产品的情况广泛存在，口蹄疫传播途径是不可预测的。