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酶工程 固定化酶(3.1.1)--固定化酶概述

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3 ． pH 的变化 - 影响酶活的机理
• （ 1 ） 改变酶的空间构象 • （ 2 ）影响酶的催化基团的解离 • （ 3 ）影响酶的结合基团的解离 • （ 4 ）改变底物的解离状态，酶与底物不
能结合或结合后不能生成产物。
固定化酶（细胞）对 pH 稳定性变化
固定化酶 pH 的变化
• 1 ） 载体带负电荷，最适 pH 向碱性方向移 动。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半
3. 评价固定化酶的指标：
• 3.
• 4.
或称偶联效率，活力保留百分数。 • 5. 相对酶活力：具有相同酶蛋白（或 RNA ）量的固定
化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力
第三节 固定化酶的制备 • 一． 一般方法及特点 • 二． 酶的固定化方法
第一节 概述 二 固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
1953 年， Grubhofev 和 Schleith 首先开 始了 酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定 化。
2 、固定化后的空间障碍效应的影响。 3 、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
阻 4 、包埋法时高分子物质进入半透膜较困难
2. 固定化后酶性质的变化
• 结论 - 固定化对酶活性的影响：
1 ）酶活性下降 2 ）反应速度下降
二． 固定化酶的性质 - 对酶稳定性的影响
（ 1 ） 操作稳定性提高 （ 2 ） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 • (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 • (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 • （ 5 ） 对变性剂的耐受力升高
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
• 一． 影响固定化酶性质的因素 • 二． 固定化后酶性质的变化 • 三． 评价固定化酶的指标
1. 影响固定化酶性质的因素
1. 酶本身的变化：主要是由于活性中心的氨基 酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
2. 固定化方法的影响
1. 影响固定化酶性质的因素 3 ．载体的影响
—— 计量单位
1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min
=6*106IU
• 2.
酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶
RNA （ DNA) 所具有的酶活力单位
—— 品质的体现
3. 评价固定化酶的指标：
• 1. 固定化酶的比活：
每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单 位面积（ cm2 ）的酶活力单位表示（酶膜、酶管 、酶板）。
特异性没有明显变化
• 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
固定化米氏方程推导
• 对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米 氏方程：
由于分配效应： ρ=[Si] 微环境 /[S] 宏观环境
6 ． 米氏常数 Km 的变化， Km 值 随载体性质变化
Km'=Km/ρ( 表观米氏常数 )
固定化酶（细胞）热稳定性变化 ( 延胡索酸酶，千烟一郎 )
固定化酶（细胞）对有机试剂（乙醇）稳定 性变化
固定化酶（细胞）对酶抑制剂（尿素）的稳 定性变化
2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 • b. 酶活力的释放是缓慢的。 • c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
3 ．固定化酶 pH 的变化
• 载体带正电荷， pH 向酸性方向移动。
• （ 2 ）产物性质对 pH 的影响 • 催化反应的产物为酸性时，固定化酶
的操作 pH 值比游离酶的 pH 值高；反 之则低
4 ． 最适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的 变化。
• 5 ． 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶
• （ 1 ） 载体与底物带相同电荷， [Si]<[S],ρ<1,Km’>Km 固定化酶降低了酶的亲和力 。
• （ 2 ） 载体与底物电荷相反，静电作用， [Si]>[S] ，则 ρ>1,Km'<Km
3. 评价固定化酶的指标：
• 1 ．酶活定义（ IU) ：在特定条件下，每一分钟催化
一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为 1 个酶活单 位。
• 固定化酶
酶工业化应用着重解决的问题？
一 是改善其稳定性 可以实施连续操作 二 是要开发出一种经济的非破坏性的回收酶的方
法
固定化
一 什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技 术
水不溶性酶（固定化酶）
•固定化酶 :
•固 定 在 载 体 上 ， 并 在 一 定 范 围 内 进 行 催 化 反 应 的 酶。
举例：
•
链霉蛋白酶 55℃ ， 120min 全失活；用乙烯和
马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活 30% ；用

溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存活 50%
。
用 DEAE - 纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃ 下加热 30min 活力仅存 4% ，而游离酶在同一 条件下存在 100% 。
一． 一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定 性研究、改进。
1 ． 四大类方法： • 吸附法（包括电吸附法） • 结合法（无机多孔材料） • 交联法（双功能试剂） • 包埋法（微胶囊法）
1960 年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化 酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上 的第一步。
1969 年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反 应用于 DL-AA 的光学分析，实现了酶连续反 应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的 开端。
1973 年，千畑一郎再次在工业上成功地固 定化大肠杆菌细胞，成功实现了 L- 天冬氨酸连 续生产。
1 ） 分配效应 2 ） 空间障碍效应 3 ） 扩散限制效应
微 环 境 是 指 在 固 定 化 酶 附 近 的 局 部 环 境 ， 而 把 主 体 溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化 - 酶活性的影响
活力变化的原因：
1 、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。

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酶工程名词解释

酶工程名词解释


12、酶反应器（enzyme reactor）：用于酶催化反应的容器及其附属设备
8、固定化酶（immobilized enzyme）：固定在载体上并在一定的吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面，而使酶固定化的方法，称……
10、包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法
11、必需水：维持分子完整的空间构象所必须的最低水量称……
名词解释：
1。酶工程：酶的生产，改性，与应用的技术过程称为酶工程。主要内容包括：微生物发酵产酶、动植物细胞培养产酶、酶的提取与分离纯化、酶分子修饰、酶，细胞，原生质体固定化、酶非水相催化、酶定向进化、酶反应器和酶的应用等。
主要任务是经过预先设计，通过人工操作活的人们所需要的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中去的过程称为酶的提取。
3、沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从沉淀中析出，与其他溶质分离的技术过程
4、凝胶层析/凝胶过滤/分子排阻层析/分子筛层析等：是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
5、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称……
6、结晶：是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。
7、固定华生物技术（immobilization biotechnoly）；通过物理或化学手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。
酶工程 固定化酶(3.2.1)--固定化辅酶

酶工程 固定化酶(3.2.1)--固定化辅酶

概 念
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结 构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与 功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大 分子结合法。 常 用 的 水 溶 性 大 分 子 修 饰 剂
聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物 (Ficoll) 、葡 聚糖、环糊精、肝素、羟甲基纤维素、聚氨基酸、 乙烯酮、
酶分子修饰的意义
• 提高酶的活力 activity • 增强酶的稳定性 stability • 降低或消除酶的抗原性 immu 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、
金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的 影响 structure
酶分子修饰的基本要求和条件
三、辅酶固定化
• 1 原因
• 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应 ( 递氢、递电子或递某些化学基团的作用）
• 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 • 有机辅因子价格昂贵
• —— 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和
再生
辅酶固定化的方法：
• 2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及 重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在 超滤器中。
• 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以 恢复或者部分恢复。
• 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不 同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有 的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。
金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶 经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯 度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶 液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四 乙酸（ EDTA ）等，使酶分子中的金属离子 与 EDTA 等形成螯合物。通过透析、超滤、 分子筛层析等方法，将 EDTA- 金属螯合物从 酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态
酶工程-酶的固定化

酶工程-酶的固定化

（2）酶与载体必须有一定的结合程度，利于反复使用。 （3）用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不易
破坏或受损。 （4）固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高
催化效率和产物的量。 （5）所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反
应。 （6）固定化酶的成本适中，以利于工业使用。
定义：利用电离辐射引发产生自由基的能力，在 室温或低温下诱发有机单体合成生物高分子材料 来包埋酶的方法。
如辐射聚合的水凝胶包埋酶。
（2）纤维包埋法
大规模生产。 把酶溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚乙烯）的有机
溶剂（二氯甲烷）中乳化，然后通过多孔喷丝头把 上述乳化液挤压进入凝结液中，即形成丝状的纤维 包埋体，酶包埋在纤维束内。 包埋量高、包埋牢固。
载体：离子交换剂。 阴 离 子 交 换 剂 ： 二 乙 氨 基 乙 基 (DEAE)- 纤 维 素 、 混 合 胺 类 (ECTEOLA)- 纤 维 素 、 四 乙 氨 基 乙 基 (TEAE)- 纤 维 素 、 DEAE葡聚糖凝胶等； 阳 离 子 交 换 剂 ： 羧 甲 基 (CM)- 纤 维 素 、 纤 维 素 柠 檬 酸 盐 、 Amberlite CG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。
载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉等； 无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、
二氧化钛、羟基磷灰石等。 纳米材料载体：聚苯乙烯、金纳米颗粒等；比表面积
大、生物相容性好，但难于分离、易产生团聚。
（2）离子吸附法 (ion adsorption)
定义：将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力 相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定 化方法。
分为： 聚丙稀酰胺凝胶包埋法 海藻酸钙凝胶包埋法 琼脂凝胶包埋法 辐射包埋法
酶工程复习资料

酶工程复习资料

由活细胞产生的生物催化剂，具有特殊作用的蛋白质，能在生命体内(包括动物、植物和微生物)催化一切化学反应，维持生命特征。

是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学， 以应用目的为出发点来研究酶， 利用酶的催化特性并通过工程化将相应原料转化为目的物质的技术。

水溶性酶经物理或者化学方法处理后成为不溶于水的但仍 具有酶活性的一种酶的衍生物，在催化反应中以固相状态作用于底物。

表示酶活力大小的尺度；一个国际单位(IU)是指在特定条件下(25℃)，每分钟内转化 1mol 底物或者催化形成 1mol 产物所需的酶量。

一个 Kat(卡塔尔，酶活性国 际单位)是指每秒钟内转化 1mol 底物所需的酶量， 1 Kat = 6107 IU 。

(酶活力：指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下， 所催化的反应初速度来表示； 是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。

) 是酶纯度的量度，是指单位分量酶蛋白所具有的酶活力，单位为 IU/mg 。

比活力越大，酶纯度越高。

比活力=活力单位数/每毫克酶蛋白。

可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) (一种变构蛋白)，通过与效应物(effector) (包括诱导物和辅阻遏物)的特异结合而发生变构作用，从而改变它与控制基因的结合力。

调节基因常位于调控区的上游。

位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，控制酶合成的时机与速度。

决定某一多肽的 DNA 模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA ，再翻译为蛋白质。

是指在一定的条件下，用适当的溶剂或者溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到 溶剂或者溶液中的过程。

是指在份子水平上不同粒径份子的混合物在通过半透膜时，实现选择分离的技术，半透膜又称为分离膜，膜壁弥漫小孔，根据孔径大小可以分为：微滤膜( )、超滤膜(uF)、纳滤膜(NF)、反渗透膜(RO)等，分离都采用错流过滤方式。