植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量

重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达李招发;于学玲;黄金路;方宏清;陈惠鹏【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2007(23)3【摘要】以毕赤酵母为表达系统,建立生产重组巴曲酶的技术工艺路线.通过递归式PCR的方法,人工合成了巴曲酶基因,将其插入pPIC9表达质粒中,转化至毕赤酵母GS115(hia4),筛选出的表达株经甲醇诱导,表达了重组巴曲酶,并得以纯化.从每升发酵液中可纯化得到10 mg重组巴曲酶,其比活为238 NIH units/mg,分子量为30.55kD.重组巴曲酶在体外可使纤维蛋白凝固,在体内缩短小鼠出血时间.为开发重组的蛇毒类凝血酶止血剂打下了基础.【总页数】4页(P483-486)【作者】李招发;于学玲;黄金路;方宏清;陈惠鹏【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071【正文语种】中文【中图分类】O786【相关文献】1.重组植酸酶appA-2 QN在毕赤酵母中的高效表达 [J], 宋玛丽;王茜;杜军;赵峰梅;梁爱华2.定点突变巴曲酶在毕赤酵母中的克隆与表达 [J], 王宏英;徐梅;兰海英;杨宇;张宏杰;李娜;薛雁;薛百忠3.巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达 [J], 薛雁;徐梅;薛百忠;王宏英;兰海英4.栓菌漆酶在毕赤酵母中高效表达及重组酶的性质 [J], 周宏敏;洪宇植;肖亚中;CUI Teng-Jiao;WANG Xiao-Tang;蒲春蕾5.碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究 [J], 王芸;华兆哲;刘立明;堵国成;陈坚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

专题27基因工程1.(2022·辽宁高考)12.抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。

为给监管转基因生物安全提供依据，采用PC方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。

下列叙述正确的是（）A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市2.(2022·江苏高考)6.采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。

下列相关叙述不合理的是（）A.用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实B.大量表达ip（细胞分裂素合成关键基因）可抑制芽的分化C.提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平可获得矮化品种D.在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因可延迟果实成熟3.(2022·山东高考)13.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（）A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质4.（2021江苏）13.下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（）A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列B.该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上C.若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异5.（2022·1月浙江选考）29.回答下列（一）、（二）小题：（二）我国在新冠疫情按方面取得了显著的成统，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。

（4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。

A卷全国卷人类对遗传物质的探索历程1.（2013·新课标Ⅱ，5）在生命科学发展过程中，证明DNA是遗传物质的实验是（）①孟德尔的豌豆杂交实验②摩尔根的果蝇杂交实验③肺炎双球菌转化实验④T2噬菌体侵染大肠杆菌实验⑤DNA的X光衍射实验A.①②B.②③C.③④D.④⑤解析孟德尔通过豌豆杂交实验发现了基因的分离定律和基因的自由组合定律；摩尔根通过果蝇的杂交实验证明了基因位于染色体上；DNA的X光衍射实验说明了DNA分子呈螺旋结构；证明DNA是遗传物质的实验有肺炎双球菌的转化实验和T2噬菌体侵染大肠杆菌实验。

答案 CDNA的结构与复制2.（2016·全国课标卷Ⅰ，29）在有关DNA分子的研究中，常用32P来标记DNA 分子。

用α、β和γ表示ATP或dATP（d表示脱氧）上三个磷酸基团所处的位置（A－Pα～Pβ～Pγ或dA－Pα～Pβ～Pγ）。

回答下列问题；（1）某种酶可以催化ATP的一个磷酸基团转移到DNA末端上，同时产生ADP。

若要用该酶把32P标记到DNA末端上，那么带有32P的磷酸基团应在ATP的（填“α”“β”或“γ”）位上。

（2）若用带有32P的dATP作为DNA生物合成的原料，将32P标记到新合成的DNA分子上，则带有32P的磷酸基团应在dATP的（填“α”“β”或“γ”）位上。

（3）将一个某种噬菌体DNA分子的两条链用32P进行标记，并使其感染大肠杆菌，在不含有32P的培养基中培养一段时间。

若得到的所有噬菌体双链DNA 分子都装配成噬菌体（n个）并释放，则其中含有32P的噬菌体所占比例为2/n，原因是___________________________________________________________。

解析（1）ATP水解生成ADP的过程中，断裂的是远离腺苷A的那个高能磷酸键即β位和γ位之间的高能磷酸键，即γ位磷酸基团转移到DNA末端。

要将32P标记到DNA上，带有32P的磷酸基团应在γ位上。

发酵工程（题库）发酵工程（题库）一、名词解释1.引物：与待扩增的DNA片段两端的核苷酸序列特异性互补的人工合成的寡核苷酸序列，它是决定PCR扩增特异性的关键因素。

2.富集培养：通过采用选择性培养基，使目的微生物大量繁殖，而其他微生物的生长被抑制，从而便于目的微生物的分离。

3.操纵子学说：调节基因的产物阻遏物，通过控制操纵子中的操纵基因从而影响其邻近的结构基因的活性。

4.生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。

5.连续发酵：连续不断的向发酵罐中流加新鲜发酵液，同时又连续不断的排出等量的发酵液，从而使pH、养分、溶解氧保持恒定，使微生物生长和代谢活动保持旺盛稳定的状态的一种发酵方式。

或以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，使培养物在近似恒定的状态下生长的培养方法。

6.聚合酶链式反应：又称聚合酶链式反应、或无细胞克隆技术，使根据DNA模板特异性模仿体内复制的过程，在体外适合的条件下，以单链DNA为模板，以人工设计合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶，从5′-3′方向渗入单核苷酸，从而特异性的扩增DNA 片段的技术。

7.代谢控制发酵：就是利用遗传学的方法或其他生物化学的方法，人为的在脱氧核糖核酸的分子水平上，改变和控制微生物的代谢，使有用的目的产物大量生成、积累的发酵。

8.菌种退化：主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。

或菌种的一个或多个特性，随时间的推移逐步减退或消失的现象，一般常指菌株的生活力、产孢能力衰退和目的产物产量的下降。

9.基因工程菌：将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌称为基因工程菌，如：大肠杆菌10.种子培养：是指经冷冻干燥管、砂土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，在经过摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量纯种的过程。

第4章第1节基因指导蛋白质的合成一、选择题1．下列对转运RNA的描述正确的是()A．每种转运RNA能识别并转运一种氨基酸B．转运RNA的三个相邻碱基是决定氨基酸的一个密码子C．转运RNA的合成在细胞质内D．转运RNA能与DNA相应的密码子互补解析：选A每种转运RNA一端的三个碱基叫反密码子，它与信使RNA 上的三个碱基——密码子进行碱基互补配对。

转运RNA是在细胞核内通过转录合成的，而不是在细胞质内合成的。

2．下列关于人体细胞内遗传信息传递和表达的叙述，正确的是()A．在转录和翻译过程中发生的碱基配对方式完全不同B．不同组织细胞中所表达的基因完全不同C．不同核糖体中可能翻译出相同的多肽D．不同的氨基酸可能由同种tRNA运载解析：选C转录过程与翻译过程中的碱基配对方式部分相同；人体内不同组织细胞中表达的基因部分相同。

在翻译过程中，一条mRNA上可能结合多个核糖体，从而使不同的核糖体中翻译出相同的多肽。

一种氨基酸可以由不同的tRNA运载，但一种tRNA只能运载一种氨基酸。

3．如图代表真核细胞中发生的某一过程，下列叙述正确的是()A．该过程表示翻译，模板是核糖体B．该图所示过程也可以发生在原核细胞中C．启动和终止此过程的是起始密码子和终止密码子，都不对应氨基酸D．图中没有酶，因为该过程不需要酶的参与解析：选B该过程表示翻译，模板是mRNA，场所是核糖体，原料是游离的氨基酸，同时需要酶、tRNA和ATP的参与。

启动和终止此过程的是起始密码子和终止密码子，起始密码子对应氨基酸，终止密码子不对应氨基酸。

原核生物中也含核糖体，也可进行翻译过程。

4．在蛋白质合成过程中，少量的mRNA分子就可以指导迅速合成出大量的蛋白质。

其主要原因是()A．一种氨基酸可能由多种密码子来决定B．一种氨基酸可以由多种tRNA携带到核糖体中C．一个核糖体可同时与多条mRNA结合，同时进行多条肽链的合成D．一个mRNA分子上可相继结合多个核糖体，同时进行多条肽链的合成解析：选D一个mRNA分子上可相继结合多个核糖体，同时进行多条肽链的合成，从而实现少量的mRNA分子指导迅速合成出大量的蛋白质。

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达王兵波;沈微;钱灵紫;李琛;罗枭;樊游;陈献忠【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)007【摘要】根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母.优化后普鲁兰酶编码基因BdP4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因BdP提高4倍以上.筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastorisGS115/pPIC9K-BdP4 WB54.在5L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液pH4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(D0)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25％的水平,甲醇流加速率为9.9 mL/(L· h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m).在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/mL以上.重组酶最适pH为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18h.【总页数】7页(P9-15)【作者】王兵波;沈微;钱灵紫;李琛;罗枭;樊游;陈献忠【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,中国高校工业微生物资源数据平台,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;苏州欧福蛋业有限公司研发部,江苏苏州,215215;帝斯曼(中国)有限公司亲水胶体事业部,上海,201203;江南大学,中国高校工业微生物资源数据平台,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文【相关文献】1.密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达 [J], 裘梁;杨萍;游清徽;董得刚;乔贝贝;王曼莹2.土曲霉植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 [J], 伍洛夫;周俊初;赵述淼3.密码子优化的乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的高效表达 [J], 刘蓉;冯志敏4.低温脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 [J], 王永杰;沈继红;丛柏林;林学政;黄晓航5.黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 [J], 彭远义;刘生峰;李春明;周泽扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

植酸酶基因phyA的克隆及在毕赤酵母中的高效表达的开题报告摘要：植酸酶（phytase）是一种可降解植物中磷酸盐形式的酶，对提高畜禽饲料的磷利用效率具有重要作用。

本研究以几种源自不同植物的植酸酶序列作为参考，设计出特异性引物并进行PCR扩增，成功克隆了一段来自小麦中的phyA基因序列。

随后将该基因序列与毕赤酵母表达载体进行连接，并利用基因工程技术将其表达于毕赤酵母中，经过优化后获得了高效的表达结果。

本研究的结果为进一步研究phyA基因的功能及其在工业上的应用奠定了基础。

关键词：植酸酶；phyA基因；PCR扩增；毕赤酵母；表达。

1. 研究背景植酸酶是一种能将植物中的植酸磷酸化合物水解成可被动物利用的无机磷化合物的酶。

在畜禽饲料中添加植酸酶可以提高饲料磷的利用率，减少磷污染对环境的影响，也减轻了饲料制造成本。

因此，植酸酶在畜禽饲料工业中具有广泛的应用前景。

phyA基因编码植酸酶，目前已在多种植物和微生物中被克隆和表达。

但是，要获得高效的植酸酶生产菌株，必须对phyA基因进行进一步研究。

因此，本研究旨在克隆phyA基因，并将其表达于毕赤酵母中，为进一步研究植酸酶的功能和工业应用提供基础。

2. 研究方法2.1. 引物的设计以已公布的几种植酸酶基因序列为参考，利用生物信息学工具设计了一对特异性引物。

引物的序列为：5'ATG CTG TGT TCA CGT GGC3'（向前引物）和5'CGA GAA TCG ACG AGA ATC TGC3'（向后引物）。

2.2. PCR扩增以小麦DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环。

2.3. 克隆和序列分析将PCR产物分离、纯化、连接到pGEM-T Easy载体上，转化到E. coli JM109中筛选正常克隆。

使用ABI 3730 DNA序列分析仪对克隆物进行测序，并用DNAstar软件进行序列分析。