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纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。
尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。
若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。
三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。
标本内的正常菌群，通常不作药敏。
对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。
不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。
除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。
若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。
四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。
表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。
纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析发表时间：2013-05-21T09:52:49.343Z 来源：《中外健康文摘》2013年第12期供稿作者：刘海珠杨燕徐建利[导读] 接种菌量加大可使抑菌圈减小，反之可使抑菌圈扩大。
刘海珠杨燕徐建利 (山东省威海市立医院264200)【中图分类号】R978.5 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）12-0154-02【关键词】抗菌药物敏感试验方法抗菌药物敏感试验(AST)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验，纸片琼脂扩散法又称K－B法，是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板表面，药物将在培养基中由纸片往周围扩散，且浓度递减。
在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[1]。
该法操作简便、选药灵活，适用于快速生长的需氧菌及兼性厌氧菌。
1 实验材料抗菌药物纸片选择直径6.35mm，吸水量20μL的专用药敏纸片，灭菌后，经逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量相当于所示浓度。
纸片冷冻干燥后储藏于密封瓶内，－20℃保存。
日常工作用的少量纸片可保存于4℃冰箱内，1周内使用。
培养基水解酪蛋白(M－H)培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2～7.4，溶化后倾注平板(琼脂厚度为4 mm)。
使用前应将琼脂平板放入35℃孵育至表面干燥。
药敏试验菌液：浓度应为0.5麦氏比浊标准。
①生长法：挑取已分离纯化的菌落4～5个，接种于3～5mLM－H肉汤中，35℃孵育4h，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。
②直接调制法：用接种环挑取纯菌落数个，混悬于生理盐水或肉汤中，充分混匀并调整浓度为0.5麦氏比浊标准[1]。
2 实验方法2.1接种以无菌棉拭子蘸取试验菌液，在管内壁旋转挤压除去多余的菌液后，涂布于整个M－H琼脂平板表面，涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1圈。
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
1. 掌握纸片扩散法（Kirby-Bauer法）的原理、操作方法和结果判读。
2. 了解纸片扩散法在抗菌药物敏感试验中的临床意义。
二、实验原理纸片扩散法是一种常用的抗菌药物敏感试验方法，其原理为：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围扩散，形成递减浓度梯度。
在纸片周围抑菌浓度范围内，待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
三、实验材料1. 标本：大肠埃希菌（18～24小时非选择性培养基上纯培养物）。
2. 试剂：营养肉汤或无菌生理盐水、直径为9cm水解酪蛋白（M-H）琼脂平板、药敏纸片（氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南）等。
3. 器材：35℃培养箱、0.5麦氏比浊管或比浊仪、酒精灯、接种环、镊子、无菌棉拭子、毫米尺或游标卡尺等。
四、实验方法1. 菌液制备：用接种环或无菌棉拭子蘸取大肠埃希菌单个菌落，接种到有营养肉汤或0.9%无菌生理盐水的试管中，制成菌悬液，校正浊度为0.5麦氏浊度。
2. 接种平板：调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部。
3. 贴药敏纸片：用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片平贴于M-H琼脂平板表面，轻压。
直径9cm的平板可贴6张纸片，每张药敏纸片之间的距离24mm，距平板边缘15mm，纸片贴牢后不要移动。
4. 培养平板：将贴好药敏纸片的M-H琼脂平板置室温干燥3～5min，倒置放入35℃培养箱中培养16～24h。
5. 结果观察与记录：观察平板上抑菌圈的大小，并记录数据。
1. 氨苄西林：抑菌圈直径为18mm。
2. 头孢唑啉：抑菌圈直径为22mm。
3. 庆大霉素：抑菌圈直径为25mm。
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
纳米材料抑菌性能实验方案纳米银和纳米金的抑菌作用是其环境效应表现的一部分。
本研究将对生物合成的银和金纳米颗粒进行详细的抑菌能力性能测试。
本实验拟采用革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli）和革兰氏阳性菌金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为模型菌进行抗菌实验。
实验采用通用的扩散法进行测定。
固体培养基组成（或LB培养基）：1L去离子水中加入蛋白胨5g，酵母提取物2g，氯化钠5g，牛肉膏1g，琼脂15g。
抑菌性能考察实验方案（1琼脂纸片扩散法，又称琼脂扩散法）取100µL细菌培养液（104cell/mL）平铺在固体培养基上，取新鲜合成的纳米颗粒50µL滴加在直径为5.5mm的圆形滤纸上，并放入固体培养基表面。
没有加入硝酸银进行纳米银合成的植物提取液作为空白样品同样进行抗菌实验。
样品最开始被放在4°C条件下进行扩散，然后在37°C条件下培养24h。
同时，采用广谱抗菌剂-庆大霉素或链霉素进行阳性实验对照。
根据抑菌圈的大小对抑菌效果进行评价。
图1 琼脂纸片扩散法抑菌性能考察实验方案（1琼脂井化扩散法，又称琼脂打孔扩散法）取1mL新鲜细菌培养液（细菌浓度为1×107 CFU）16-18h细菌培养液（刚过对数增长期）平铺在琼脂培养皿上。
自然干燥5min以后，使用无菌打孔器在琼脂板上开凿直径约5mm的孔，每个培养皿开凿4个孔，分别位于培养皿对称四个角上，如图所示。
然后用移液枪分别向各孔中滴加50µL不同浓度的提取液和生物合成纳米颗粒胶体溶液。
然后，将培养皿在37°C下培养24h。
在实验过程中，采用链霉素或庆大霉素作为阳性对照实验。
经过培养以后，细菌的生长抑制可以通过测定井化抑菌圈尺寸来进行考察。
实验需要平行三组样品。
图2 琼脂井化抑菌实验图3.6. Silver nanoparticle immobilization on cloth and disk diffusion studiesThe cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles did not show much difference in texture, wherea the cloth immobilized with PVDF containing silver nanoparticles turned slightly rigid. This change in texture is due to PVDF occupying the interface area of the fiber and forming a membrane-like structure upon drying. PVDF was selected based on its hydrophobic property, stability at wider range of temperatures and inertness to many chemicals. Fig. 5 shows the disk diffusion studies at various concentrations of silver nanoparticles. The cloth sprayed with sterile water and PVDF devoid of silver nanoparticles served as controls for respective plates. There was totally no inhibition by the cloth sprayed with only sterile water, whereas cloth sprayed with only PVDF showed mild inhibition of bacterial growth. From the Fig. 6, it was clear that increase in silver nanoparticle concentration increased the inhibition zone area on the plate, which directly represents the increase in toxicity. The cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles showed larger inhibition zone than cloth immobilized with PVDF. This may be attributed to the free availability of the silver nanoparticles in cloth immobilized with sterile water. In cloth immobilized with PVDF, a coat of the polymer might slightly inhibit the availability of the silver nanoparticles and thereby its toxicity. But the inhibition zone around the cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles decreased vastly in consecutive cyclesafter washing compared to cloth immobilized with PVDF (Fig. 6). The purpose of using PVDF in the present study is to bind the silver nanoparticles to the cotton cloth, which will decrease the loss of the silver nanoparticles in consecutive washing. Thus as expected the loss of silver nanoparticles was lesser in cloth immobilized with PVDF compared to cloth immobilized with sterile water. In case of the cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles,Fig. 5. Image of Petri plates showing the growth inhibition of E. coli by (A) cloth immobilized with silver nanoparticles using sterile water and (B) cloth immobilized with silver nanoparticles using PVDF.Fig. 6. Growth inhibition of E. coli in consecutive cycles by (A) cloth immobilized with silver nanoparticles using sterile water and (B) clothimmobilized with silver nanoparticles using PVDF.。
纸片扩散法抗菌药物敏感试验的质量控制钟伟萍【摘要】目的抗菌药物敏感试验是临床抗菌治疗的指导性实验.关系到抗菌药物治疗成败.方法多种方法中选WHO推荐使用的利于基层医院开展的纸片扩散法.结果日常常规操作中应控制好平板厚度、琼脂浓度、细菌接种量、琼脂种类及多种因素.结论在严把纸片扩散法抗菌药物敏感实验的操作过程的同时,有必要做好质量控制,确保结果准确性,服务于临床.【期刊名称】《中国卫生产业》【年(卷),期】2017(014)026【总页数】2页(P38-39)【关键词】纸片扩散法;抗菌药物敏感试验;质量控制【作者】钟伟萍【作者单位】山东省青岛大学附属威海市立第二医院,山东威海 264200【正文语种】中文【中图分类】R446.1在临床感染性疾病、菌种的耐药性、抗生素的合理应用等。
抗菌药物敏感试验是实验室不可缺少的，常用方法有Etest法、稀释法、Kirby-Bauer法以下简称（K-B 纸片扩散法）以及全自动微生物分析仪等。
纸片扩散法是WHO推进使用的微生物敏感性测定方法[1]，能在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[2]。
其特点是操作简单，测定的药物可随临床需要而调整，易检测个别特殊耐药菌株[3]，更重要是扩散法有一套完整的质量控制，结果可靠，是微生物常用方法，全自动或半自动仪器分析法是一种微量肉汤稀释法[4]。
该文将平时工作中的质量控制要点阐述如下。
一次质量控制结果错误，常被认为是一种统计上的随机变化。
①接种平皿不均匀；②抑菌环量取记录直径有误；量取工具有误差；③标准菌株保存、污染、过期等改变；④细菌接种量，在K-B纸片扩散法药敏实验菌液量规范中提出固定接种0.35 mL菌液量[5]；⑤0.5管麦氏浊度管未摇匀、已过期；⑥孵育温度、时间、放置、气体等不合格；⑦MH培养基制作、深度、厚度、购入批次批号等有关；⑧药敏纸片质量改变。
立即观察药物平板，重复试验一般能够解决，如仍失控必须恢复每日质控查找原因。
浅谈纸片扩散法药敏试验
洪英;黄雁;魏良宇
【期刊名称】《福建畜牧兽医》
【年(卷),期】2004(026)005
【摘要】纸片扩散法药敏试验主要是观察兽医临床用药中抗生素的抑菌效果的一
种检测方法，是基层单位选择药物治疗经常进行的工作之一。
药敏试验的方法很多，常用的方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、Etest法、自动化药敏仪测定等。
目前正在研制和推广的方法还有DNA异源双链分析法、
【总页数】2页(P56-57)
【作者】洪英;黄雁;魏良宇
【作者单位】福建省动物疫病诊断中心;福建省动物疫病诊断中心;福建省动物疫病
诊断中心
【正文语种】中文
【中图分类】Q503
【相关文献】
1.谈纸片扩散法细菌药敏试验的影响因素 [J], 车凌云;张妮
2.纸片扩散法细菌药敏试验的影响因素分析 [J], 林协;鄢化章
3.直接纸片扩散法对阳性血培养的药敏试验诊断价值 [J], 杨勤英;代雨荣
4.药敏试验-纸片扩散法影响因素的探讨 [J], 花扣珍;徐建军
5.纸片扩散法常规检测淋球菌药敏试验可靠性探讨 [J], 邓育芳;陈晓能;曾福英
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纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
