中国药典微生物限度标准60页PPT

微生物限度检查法
《中国药典》2015年版修订后将分为三个附录： – 1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 – 2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 – 3、非无菌药品微生物限度标准
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整体概述
概况一
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概况二
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1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
• 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动 检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定 的检查方法。
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1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
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1.1 Байду номын сангаас则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。

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操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-1996 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
• 取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂 酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化 混合物（温度低于45℃）的烧杯中，用无 菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的 稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充 分乳化，作为1:20供试液。
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特殊供试液制备方法
• 取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的 无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振 摇，使供试品溶解，再加入约45℃的稀 释剂，振摇5-10分钟，萃取，待油水明 显分层，取其水层作为1:10供试液。
• 一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一 个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试 品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单 位数（colony forming unity, cfu）
• ·供试品检验的全过程必须符合无菌技术 要求。
• 培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按 灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的 灭菌程序灭菌。
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操作要点
• 作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。 • ·细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落极小，不
易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。 • 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定
• 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或 cm2）
• 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小 包装单位）的3倍量供试品。

中国药典2010版药品微生 物检查
我国微生物检查发展概况 抑菌剂效力检查法指导原则 药品微生物检验替代方法验证指导原则 微生物限度检查法应用指导原则 药品微生物实验室规范指导原则
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2010版药典起草的指导思想
一、以科学发展观为统领，服务于资源节约
型社会、环境友好型社会的要求；落实科学监 管理念，着力解决发展中的问题。
2010版中国药典，我国药品无菌、微生物限 度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接 轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物 限度检查步入了一个崭新的时期。
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抑菌剂效力检查法指导原则
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如果药物本身无足够的抗菌力，在正常储存和
使用过程中（尤其是多剂量制剂）可能发生微生物 污染和大量繁殖，对患者造成感染或引起药物变质。 最近我国白内障病人感染铜绿假单胞菌事件，以及 目前国外尚在调查的博士伦护理液的问题，足以提 醒我们此类制剂微生物污染的严重后果。在生产过 程中添加适合的抑菌剂可以保证药品在正常储存和 使用过程中的质量。
二、坚持继承、发展、创新的原则 三、坚持科学、实用、规范的原则 四、坚持质量可控性原则 五、坚持标准先进性原则 六、坚持标准发展的国际化原则
205版的基础上增订了白色念珠 菌的检查，规定眼用制剂按无菌制剂要求，明确用 于烧伤或严重创伤的外用剂型均按无菌要求。中药 橡胶膏剂首次提出不得检出致病菌检查要求。新增 抑菌效力检查法指导原则、药品微生物检验替代方 法验证指导原则、微生物限度检查法应用指导原则、 药品微生物实验室规范指导原则等，以缩小附录在 微生物检查方面与国外药典的差距。
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所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂

金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌 修订后 耐胆盐革兰氏阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿
假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌
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2015版药典微生物检查法修订内容——结果判断 微生物计数法和控制菌检查法结果判断 不再规定复试，通过实验室调查、回顾、分析结果
的准确性。 限度标准以指数方式表示： 10的一次方cfu：可接受的最大限度为20； 10的二次方cfu，可接受的最大限度为200；以此类
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2015版药典抑菌效力检查法修订内容
抑菌剂：是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。 1.抑菌效力检查法系用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，
以评价最终产品的抑菌效力。 2.用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定，
以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污 染和繁殖是药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量 包装的制剂。 3.抑菌剂不能替代药品生产的GMP管理，不能作为非无菌制 剂降低微生物污染的唯一途径。 4.所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最 低有效量。
型限制 4.微生物限度标准 5.控制菌检查：保留部分生化试验 6.修订后，控制指标更合理，计数方法及标准合理、
准确，反映真实污染情况
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2015版药典微生物检查法修订内容——环境要求
目前我国药品微生物检测对环境的要求与国际标准 分级不一致。
国际要求：只要洁净环境分为A级、B级、C级、D级。 A（百级）、B（千级）、C（万级）、D（十万级）。 协调案要求：试验在经过设计的可避免外来微生物
2015版《中国药典》微生物学 检验技术实施指导与修订解读
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内容简介 一、2015年版《中国药典》微生物学检验的发展和修订 二、非无菌产品微生物检查：微生物计数法 .修订依据 .格式变化 .适用范围 ④.环境要求 ⑤.微

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2015版微生物检验
• 实现了三部药典标准的统一 • 形成了一个比较完备的药品微生物检验标
准体系，具有以下两个显著特征 • ①全面与国际标准接轨； • ②推动了药品微生物控制由终产品检验向
过程控制转变。
真核微生物形态
• 真核微生物：是细胞核具有核膜、核仁， 能进行有丝分裂，细胞质中存在线粒体或 同时存在叶绿体等多种细胞器的一类微生 物。
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酵母菌特性
①个体一般以单细胞状态存在 ②多数为出芽繁殖，也有裂殖； ③能发酵糖类产能； ④细胞壁常含甘露聚糖； ⑤喜在含糖量较高、偏酸性环境生长。
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2015版微生物检验
• 微生物基础知识 • 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数
法(通则1105)解析 • 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查
法(通则1106)解析 • 非无菌药品微生物限度标准(通则1107)解析 • 培养基的质量管理 • 工艺用水的检查 • 无菌检查法 (通则1101)解析
微生物的分类
• 原核微生物：细菌、放线菌、立克次氏体 支原体、衣原体、蓝细菌和古细菌
• 真核微生物：酵母菌、霉菌、粘菌、原生 动物和藻类
• 非细胞型生物：病毒、噬菌体、类病毒、 拟病毒和朊病毒
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微生物特点
检测环境变化
• 微生物计数试验环境要求

4、细菌、霉菌及酵母菌计数
---计数培养基的适用性检查
CP2005 无 CP2010 计数培养基的适用性检查 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养 基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或 按培养基处方配制的培养基均应检查。 本版药典重大变动之二
4、细菌、霉菌及酵母菌计数
---计数培养基的适用性检查
4、细菌、霉菌及酵母菌计数
---计数培养基的适用性检查
CP2005 无 CP2010 结果判断 被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大 于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养 基的适用性检查符合规定。
培养基的管理使用，详见药品微生物实验室指导规范原则。
4、细菌、霉菌及酵母菌计数
本版药典重大变动之一
检验结果以1g、1ml、10g、10ml或 检验结果以1g、1ml、10g、10ml 10cm2为单位报告、 、10cm2为单位报告，特殊品种 以最小包装单位报告。
2、检验量
CP2005 CP2010
化学膜剂为100cm2
要求检查沙门菌的供试品，其检 验量应增加10g或10ml。
CP2005
无
CP2010
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50-100cfu，分别 注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制 备2个平皿，混匀，凝固，置30-35 ℃培养48小时，计数。 取白色念珠菌、黑曲霉各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾 注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝 固，置23-28℃培养72小时，计数。
药典微生物限度检查法及指导原 则培训
• 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原 料、辅料是否符合药典的规定，

微生物限度检查：粉雾剂、口服溶液剂、口服混悬剂 、 口服乳剂、搽剂、洗剂、局部用片剂、酊剂、栓剂、 糖浆剂、膜剂、贴剂 、灌肠剂 、糊剂 、涂剂、涂膜 剂。
原则性要求：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。 12
2、2005版中药制剂通则项下的微生物限度要求 无菌检查：注射剂。
无菌检查及微生物限度检查：散剂、软膏剂、眼用制 剂、鼻用制剂、气雾剂、喷雾剂。
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2.口服给药制剂
●不含药材原粉的制剂 ●含药材原粉的制剂 ●含豆豉、神曲等发酵成分的制剂
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3. 局部给药制剂
⑴ 用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂（无菌） ⑵用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂 ⑶用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂 ⑷眼部给药制剂（由100，不得检出→10，不得检出） ⑸耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 ⑹阴道、尿道给药制剂（含生药原粉的深部用药，破伤风杆菌→梭菌） ⑺直肠给药制剂 ⑻其它局部给药制剂
● 操作环境 洁净度：微生物限度检查应在环境洁净度10000级
下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。 洁净度定期检测:单向流空气区域、工作台面及环境 应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮 游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进 行洁净度验证。
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●细菌培养温度:30～35℃。 ●霉菌、酵母菌培养温度:23（25）～
28℃。 控制菌培养温度:35～37℃ ●结果报告：以1g、1ml、10g、10ml 或
10cm2 为单位报告。
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（2）检验量
● 抽样量 ：随机抽取不少于检验量（两个 以上最小包装单位）的3倍。
● 检验量：一次试验所用的供试品的量。 一般为10g或10ml；中药膜剂50 cm2， 化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包 装的药品酌减（不得少于3g）。

加热溶化 • 注皿时培养基应在45±1℃，高于45℃时易造成细菌受损或致死，
低于45℃时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较 好。 • 倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上， 以免影响实验结果。
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操作要点
采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将
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洁净级别
洁净级别
尘粒数/m3
浮游菌
个/m2
微粒直径 微粒直径
≥0.5um ≥5um
100
≤3,500
≤0
≤5
沉降菌 个/0.5h
≤1
10000 ≤350,000 ≤2000 ≤100 ≤3
100000
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≤3,500,000 ≤20,000 ≤500
≤10
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检验量
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操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-2019 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
– 当仅有１个稀释级的菌落数符合上述规定， 以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报 告菌数。
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菌数报告规则
当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比 值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以 低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值 ）而定。若比 值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均 值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级 的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大 于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落 数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应 进行方法的重新验证。

- 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及 对微生物的生长和存活无影响。
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
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稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
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验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
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验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件

微生物限度标准
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
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谢谢！
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华