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实验五母种、原种接种扩大培养（板书用）一、实验目的熟悉母种、原种接种操作技能。
二、实验材料和用具接种箱或超净工作台，恒温培养箱，接种钩（针），酒精灯，镊子、、火柴，记号笔，记录本，75％酒精及棉球、95％酒精，母种试管斜面，灭菌好的原种培养基。
三、实验步骤与方法1.无菌测定灭菌后的培养基，随机抽出数支斜面试管培养基，置25—28℃的温箱中培养3天，培养基表面仍光滑，无杂菌出现，证明灭菌彻底，即可供接种使用。
2.接种操作过程无菌操作要点：①无菌箱在启用前先灭菌，将待接种的斜面试管、酒精灯、火柴、接种针等放入箱内，紫外线照射半小时以上。
超净工作台则要先灭菌20分钟。
②双手洗净。
打开工作灯，将双手伸入接种箱内，点燃酒精灯。
用75%酒精的棉球擦拭双手，擦拭方向由前向后。
③左手平托两支试管，拇指按住试管底部，外侧一支是供接种用的菌种试管，内侧一支是待转接母种的斜面试管，两支试管的斜面都应朝上。
右手持接种钩，将接种钩的顶端烧红，并将整条接种柄在火焰上过几次灭菌。
④将两支试管的管口部分靠近火焰，用右手同时夹住两个棉塞。
拔掉两支试管的棉塞，并立即以火焰灼烧管口，并适当转动。
操作过程在不离酒精灯火焰一寸远处进行。
⑤用冷却的接种钩，在长满菌丝的斜面挖取少许菌丝及培养基，然后轻轻抽出试管。
迅速伸进待接试管中，将种块置于培养基的中部，盖好塞子。
接种过程中，应注意保持试管与桌面平行，不要远离酒精的火焰，周而复始。
一支母种可扩接20—25支试管。
贴上标签（或用记号笔），注明菌种或菌株名称及日期。
⑥原种接种：3．菌种培养接好种的试管和原种，放在25℃条件下培养，每隔2-3天检查一次。
遇有杂菌的试管要及时选出，以免污染其他试管。
7～10天后菌丝就可长满试管。
原种30天左右长满。
作业：归纳原种和试管种的接种全过程。
实验五母种接种扩大培养一、实验目的通过对接种箱常规消毒、斜面试管培养基母种(即一级种)接种和培养，基本熟悉母种接种操作技能。
食用菌的制种（母种的分离和培养）()---食用菌菌种质量的优劣，直接影响到栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种，才能获得优质高产的食用菌。
因此食用菌的制种，是生产中一项极其重要的工艺。
食用菌的菌种按培养阶段和来源的不同，可分母种、原种和栽培种三种。
从食用菌的孢子分离培养或从组织分离培养、基内菌丝分离培养所得到的第一代菌丝体，称为母种。
从母种扩大培养的菌丝体，称为原种。
从原种扩大培养直接用于生产上播种的菌丝体；称为栽培种。
一、母种的分离和培养（一）母种培养基的配制1.母种培养基的种类母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。
因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。
适合母种菌丝生长的琼脂培养基种类很多，常用的有下列几种：（1）马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基马铃薯（去皮） 200克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（2）麦芽汁——葡萄糖——琼脂培养基干麦芽 250克琼脂 15～20克葡萄糖（或蔗糖） 10克水 1000毫升（3）胡萝卜——葡萄糖——琼脂培养基胡萝卜 100克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（4）蘑菇汁——葡萄糖一一琼脂培养基（适用于蘑菇）鲜蘑菇 250克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（5）蛋白胨——葡萄糖——琼脂培养基蛋白胨 2克葡萄糖 20克磷酸氢二钾 2克维生素B1（硫胺素） 0.5毫克磷酸二氢钾 0.5克琼脂 18克硫酸镁 0.5克水l000毫升2.母种培养基的制法兹以最常用的马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基的制法为例介绍如下：先将马铃薯去皮，洗涤，切成小块，加水1000毫升，煮沸15～20 分钟，取双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加热使其溶化，最后补足水分，使其容量仍为1000毫升。
趁热分装于试管中，装量约为试管长度的1/5左右，装管时要注意不使培养基沾污试管壁和试管口。
食用菌栽培技术一、菌种制备菌种制备包括母种、原种、栽培种三级菌种。
1、母种培养基的制作。
常用的主要有以下几种：（1）马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（PDA培养基）。
马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂18～20克，水1000毫升。
（2）猴头菌培养基。
黄豆芽250克加水1000毫升，煮沸15～20分钟，过滤取汁，补足失水至1000毫升。
加入葡萄糖30克、蛋白胨5克、酵母膏1克、琼脂20克，加热溶化，然后分装。
适用于猴头母种培养。
（3）玉米粉培养基。
玉米粉30克左右，葡萄糖20克，琼脂20克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克、蛋白胨0.5克。
玉米粉煮至70℃左右保持1小时，然后加上其余的成分。
2、原种培养基的制作。
常用配方：（1）棉耔壳培养基。
棉耔壳100斤，麦麸15斤，石膏粉1.5斤，料水比1:1.1～1.2。
该培养基适合于大多数食用菌品种。
（2）木屑培养基。
干木屑100斤，麦麸20斤，蔗糖1斤，石膏粉1.5斤，硫酸镁0.5斤，料水比按1：1.1～1.2。
该培养基适合于银耳、黑木耳、猴头、金针菇、平菇等原种培养。
（3）粪草培养基。
稻草63斤，玉米粉4斤，大豆粉3斤，干牛粪25斤，过磷酸钙3斤，硫酸镁2斤，料水比1：1.1～1.3。
适合于双孢菇原种培养。
其中牛粪也可以鸡粪等等畜粪来代替，只是所加的量根据其所含氮量而定。
（4）谷粒培养基。
选新鲜、无虫、无霉变的小麦、（大麦、谷子、高粱、玉米粒均可），淘洗干净，按1：2.0比例加水，煮沸30分钟，闷4～6个小时，沥去水分，标准是“煮透晾干”，再加入干料1%的石膏粉，0.5%的石灰拌匀、装瓶。
适用于平菇、双孢菇原种培养。
该种培养基发菌快，在时间紧迫的情况下采用此培养基可以大大的节省时间。
3、培养基灭菌。
（1）高压蒸汽灭菌法。
主要用于母种，灭菌的条件是0.11～0.12千帕。
原种灭菌一般是0.12千帕，1.5小时。
（2）常压蒸汽灭菌。
主要用于原种和栽培种。
灭菌的条件一般是灭菌器内达到100℃后保持8～10个小时。
食用菌原种的灭菌、接种与培养
(1)灭菌
分装好的原种瓶，要当天灭菌，以免培养基发霉变质。
灭菌方法有二种，即高压蒸汽灭菌和常压蒸汽灭菌。
①高压蒸汽灭菌。
先将锅内加入足够的水，将菌种瓶整齐地排放在锅内，盖上锅盖，对角拧紧锅盖上的螺丝，勿使漏气。
用电炉或者煤火加热，当压力达到0.05兆帕时，打开放气阀（或开始就打开放气阀），排空锅内冷空气，放气10-15分钟左右，再关闭放气阀继续加热，当压力升到0.15兆帕时，调整火力使压力维持在0.14-0.15兆帕下灭菌。
麦粒和谷粒培养基灭菌120分钟；棉籽壳、玉米芯、木屑培养基灭菌90-100分钟。
灭菌完毕，关闭热源，待压力自然降到0时，打开放气阀将锅内空气排尽后，再打开锅盖取出菌种瓶。
②常压蒸汽灭菌。
锅内加足水，先用大火加热，使蒸汽上足后，用小火保持沸点温度。
在loo℃左右的沸点温度下维持12-16小时以上，停火焖1夜后出锅。
麦粒和谷粒培养基灭菌时间要相应延长。
为了确保灭菌效果，麦粒和谷粒培养基最好不要采用常压灭菌法。
(2)接种
①培养基冷却。
将灭过菌的培养基从锅内取出，置于干净的室内冷却，待灭过菌的培养基温度降至30℃以下时，搬入消毒好的接种箱（室）内消毒接种。
②接种场地的消毒。
在接种前先对接种场地和接种设施进行彻底的
1。
食用菌生产技术流程
一、菌种生产
1.食用菌菌种的概念
食用菌的菌种不是真正意义上的种子,它是营养体,相当于农作物的“苗”。
作为微生物,它相当于我们蒸馒头用的“酵子”,制菌种实际上就是不断扩大“酵子”的过程。
2.菌种分级、培养时间及数量
母种—(7-10天)—→原种—(30天左右)—→栽培种—(30左右)—→生产;香菇栽培种需50—60天
母种—(20-30支)—→母种—(4-5瓶)—→原种—(40-50袋)—→栽培种,香菇栽培种一袋接15袋左右
3.生产工艺流程
培养基配制—→分装—→灭菌—→冷却—→接种—→培养(检查)—→成品。
二、几种主要食用菌的生产流程
1、香菇、木耳、金针菇等所有熟料栽培技术流程:
备料→配料→装袋→灭菌→冷却→接种→菌丝培养→开口催蕾→出菇管理→采收。
2、平菇等所有生料栽培技术流程:
备料→配料→发酵→接种→菌丝培养→开口催蕾→出菇管理→采收。
三、栽培设施:
除带后墙,带后坡的高效温室不需加温即可出菇外,其它设施从交九后一九到四九期间不加温不能出菇。
四、几种主要食用菌的栽培流程
附表。
食用菌的菌种分类我们根据食用菌菌种制作方式的不同，可以将食用菌菌种分为固体菌种和液体菌种两大类：一、固体菌种母种→原种→栽培种1、母种母种：在试管或平皿琼脂培养基上生长的纯菌种称为母种，因为是用试管制作的，也称之为试管种，因为是最早一级的菌种，也称之为一级种。
试管的规格一般为22mm×220mm、20mm×200mm、18mm×180mm三种，如果采用液体菌种建议使用18mm×180mm，封口用棉花或硅胶塞。
平皿的规格为直径90mm，封口用Parafilm封口膜。
为了扩大生产，母种可以转接成更多的母种，叫做母种的扩繁。
在各级菌种中，母种的纯度最高，决不允许有杂菌污染。
衰老和退化的母种也不能投入生产，出现不纯或者退化的母种要进行提纯和复壮，提纯和复壮不能达到效果就应该淘汰。
母种的来源有两种，一种是从科研单位及菌种生产机构购买的，一种是组织或孢子分离后经出菇试验确认遗传稳定和高产的母种。
母种培养时间：7-10天，不同品种有差异。
2、原种原种：原种是母种的菌丝体转接到棉籽壳、玉米芯、木屑或高粱粒、麦粒、枝条等固体培养基上培养而成的食用菌菌种，也叫做二级种。
原种制作的容器有：500ml罐头瓶、750ml罐头瓶、点滴瓶、专用菌种瓶等，罐头瓶封口用菌袋裁成见方封口，点滴瓶用棉花封口。
原种的用途是扩繁栽培种用的，即母种→原种→栽培种→栽培袋，也可以用原种直接转接到栽培袋中，即：母种→原种→栽培袋，这样不仅能够缩短菌种制作周期，也能更好的保证菌种纯度。
原种培养时间：20-30天，根据制作容器和品种不同而有差异。
3、栽培种栽培种：原种经过转接扩大繁殖后称之为栽培种，栽培种用于转接栽培袋，是生产中使用量最大的食用菌菌种，也叫做三级种。
三级种制作的容器有：500ml罐头瓶、750ml罐头瓶、点滴瓶、专用菌种瓶等，除了这些和原种一样的容器，栽培种使用最多的是15cm×30cm、17cm×33cm的折角袋，封口用棉花或者专用的无棉盖体。
食用菌母种培养基的灭菌方法及步骤食用菌生产中的灭菌和消毒是有本质区别的，灭菌是杀死杂菌及其芽孢的过程，消毒是杀死食用菌表面部分病原微生物的过程。
小编今日介绍一下食用菌母种培养基的灭菌方法与步骤等技术，供参考。
一、食用菌母种培养基的灭菌方法在食用菌母种培养基制作中常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，该法灭菌较为彻底，具体方法步骤及注意事项如下：1、选锅、加水选用手提式高压蒸汽灭菌锅，向灭菌锅内加水至水位标记高度。
注意：水不可过多也不可过少，过少易烧干，过多棉塞易受潮，引起杂菌污染。
2、装入培养基把培养基有序竖直排放入灭菌锅内，留开通气孔，并保证蒸汽流通。
试管口和棉塞不能直接接触锅壁，上面要盖2层报纸或1层防水油纸，防止锅盖下面的冷凝水打湿棉塞。
最后均匀拧紧锅盖上的螺丝，防止漏气。
3、加热灭菌将装入培养基的灭菌锅放置在2-3千瓦的电炉上进行加热，当压力升至0.05兆帕时，打开放气阀缓慢放气，让压力降至零，再放气10-15分钟，当有大量热蒸汽排出时，关闭放气阀升压灭菌。
当压力升至0.11-0.12兆帕时，开始计时，并调节火力大小，始终维持所需压力30分钟。
4、停止加热，缓慢减压在0.11-0.12兆帕压力下．灭菌30分钟后，停止加温，待压力自然下降到0时打开放气阀，缓慢排出残留蒸汽；然后打开锅盖，待热蒸汽冷却片刻后，取出灭菌物品。
灭菌完后，若连续使用，应注意补足水分后再用。
若暂时不用，应排出锅内剩余水分，清理干净，下次备用。
二、食用菌接种场所的消毒方法首先将接种箱、接种室或者接种帐的卫生打扫干净；然后放入所有用具及母种培养基，用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒。
药品用量为每立方米甲醛10毫升，高锰酸钾5克。
熏蒸后的接种箱、接种室或者接种帐还可用紫外线辅助杀菌，一般10立方米的空间，用30瓦的紫外线灯照射30分钟，待臭氧散去，即可开始接种。
若采用超净工作台接种，首先要将超净工作台用清洁的水和干净的抹布擦洗干净，然后再用75%的酒精擦拭，放入接种用具和母种培养基，开机吹无菌风30分钟。
食用菌原种和栽培种培养料的制作实验一、目的要求掌握常见食用菌原种和栽培种培养基的制作、接种和培养技术。
二、材料与用具(1)材料:优质小麦、棉籽壳、木屑、稻草、玉米面、葡萄糖或蔗糖、右膏粉、碳酸钙等。
(2)用具:电户、大铝锅、大盆、菌种瓶、12cm x 12cm x0.02cm高压聚丙烯塑料膜、线绳、接种箱、超净工作台、酒精灯等。
三、内容与方法(一)培养基的制作1.麦粒原种培养基制作谷粒(如麦粒，玉米粒)南种培养基制作难度较大，但优点很多。
谷粒营养丰富，大小适中，是绝大多数种类食用菌原种制作的最佳原料。
现以小麦原种培养基制作为例，介绍如下。
(1)麦粒培养基配方:常用麦粒培养基配方为小麦99%、石膏粉1%。
(2)制作方法①泡小麦:冬天浸泡24 ~ 48h,隔夜换水;夏天浸泡10~12h,隔友换水，可加人1%石灰浸泡。
泡好后，小麦粒饱胀，用清水漂洗干净，除去杂质。
②煮小麦:煮至充分吸水，无白心，切忌煮开花。
③木腐生菌类一般添加一定量木屑(10%左右)效果更好:木屑可用煮小麦的水拌料，料:水以1:0.5的比例拌和，或酌情处理;可添加木屑干重0. 5%的蔗糖、0. 5%的尿素、1% 的石灰。
④装瓶:将小麦粒捞出后，趁热滩平，使表面多余水分蒸发，然后加人石膏粉或其他辅料拌匀，再将料装至瓶肩处即可。
⑤封瓶口:用两层完整的塑料膜封瓶口并套好皮筋。
⑥灭菌:麦粒菌种一般采用高压灭菌方式。
高压灭黄于126℃左右维持2h即可。
其排冷气，开锅方法同斜面培养基制作。
2.其他原料制作原种和栽培种培养基(1)粪草培养基(适于制作双孢磨菇菌种)配方:粪草(粪:草=6:4, 堆积发酵15 -20d) 90g,，米桃或麸皮8g，碳酸钙1kg，糖1Kg，水适量。
制作方法:先将粪草堆积发酵，发酵时间18d左右，其间加人米糠等辅料，翻准2-3次，晒干，切碎，装瓶，灭菌。
灭菌方法同麦粒培养基。
(2)木屑-米糠培养基(适宜各种木腐生食用菌)配方:阔叶树木屑70%~ 80%，米糠或麸皮20%~28%，碳酸钙1%，蔗糖1%，石膏1%，水调至适量。
食用菌母种、原种、栽培种制作步骤食用菌菌种的质量对食用菌生产至关重要。
菌种的好坏，菌种的保存直接影响到食用菌的产品质量和产量、效益和成败，所以我们要制作优良的食用菌菌种，更要有优良的菌种保存方法，以保存菌种的生活力和优良性状，确保菌种纯种、无污染。
一、菌种制作食用菌菌种分三种即母种（一级种）、原种（二级种）、栽培种（三级种）1.制作母种（一级种）1.1菌种采集选择健壮无病虫害的食用菌子实体。
经表面消毒后，放在无菌的厚纸上，使子实体菌褶向下，在通风条件下经过12--24h，等子实体放出孢子后，将纸折叠起来风干，放入塑料袋中，里面放几粒干硅胶，封好口，放入2--4℃冰箱中，可保存起来长期备用。
1.2母种培养基制作配方：马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、纯净水1000ml。
先把马铃薯切成大约1cm大的小方块，放入1000ml 纯净水中煮30min，过滤后加入琼脂、0.2-0.3%的磷酸二氢钾、再加入20g葡萄糖，溶解后分别装入试管，每个试管装量1/5-1/4，用棉塞封好试管口，外加塑料膜扎紧，放入压力灭菌锅1.3㎏/cm灭菌30min，待温度降至60℃将试管摆成30-35度倾斜面，冷却后观察几天，无受到杂菌污染即可接种，孢子液用灭菌的自来水将孢子稀释，在无菌操作环境下将孢子悬浮液移到试管琼脂斜面上，在25℃下培养，很容易萌发生长成菌丝，然后用石蜡封口置于4-5℃恒温箱中可保存6个月。
2.制作原种（二级种）将木屑78%、麦麸20%、糖1%、石膏1%加入水拌匀（100kg料加125kg水），培养基原料拌匀后拿试纸测ph 值，ph值在6-7为宜，然后装入大口的罐头瓶至瓶肩部，将培养料压平压紧，抹干净瓶的培养料，拿完好无破损的塑料薄膜扎紧瓶口，放入压力灭菌锅1.4-1.5㎏/cm灭菌1.5-2h，冷却至25℃即可进行无菌接种，用接种针从母种试管斜面上挑取少量菌丝体接入瓶中，接种后在25℃恒温箱中培养30d菌丝可长满，即可作为原种（二级种）。
食用菌母种1级种培养基、
食用菌原种2级种培养基
简法生产与灭菌创新技术
湖北省宜都市湾市食用菌天麻繁育场的科技人员经过多年探索实践，研究成功食用菌母种1级种试管培养基、食用菌原种2级种培养基简法灭菌创新技术。
其技术涵盖了食用菌菌种母种1级种试管培养基简法复制生产创新技术及简法灭菌创新技术和食用菌菌种原种2级种培养基简法复制生产创新技术及简法灭菌创新技术。
现将其技术要点介绍如下：
1. 食用菌菌种母种1级种试管培养基简法生产与复制创新技术
该技术采用湖1北3省8宜72都市52湾市33食用58菌天麻繁育场技术总监胡文华发明的“广谱通用型食用菌菌种培养基生产技术”。
这种广谱通用型食用菌菌种培养基以颗粒型谷物为原料，谷粒、麦粒、玉米粒均可，简称颗粒培养基（下同），又称天然无公害培养基。
这种颗粒培养基制作方法特别简单，取谷粒、麦粒、玉米粒一种或多种，与胡文华发明的食用菌种包衣剂混合均匀后，就可以分装试管了。
1支试管（18毫米×180毫米玻璃试管）装入颗粒培养基约10克，成本不足1角钱，棉花塞堵封试管口。
一次可根据生产需要，制作分装试管500支～1000支。
2. 食用菌菌种原种2级种培养基简法生产与复制创新技术
该技术同样采用湖1北3省0宜85都市16湾市86食用16菌天
麻繁育场技术总监胡文华发明的“广谱通用型食用菌菌种培养基生产技术”。
这种广谱通用型食用菌菌种培养基以颗粒型谷粒、麦粒、玉米粒为原料。
取谷粒、麦粒、玉米粒一种或多种，与胡文华发明的食用菌种包衣剂混合均匀即可。
盛装原种2级种培养基的容器为250毫升输液瓶即生理盐水瓶。
1瓶装入颗粒培养基约100克，成本不足5角钱，棉花塞堵封瓶口。
一次可根据生产需要，制作分装100瓶～500瓶。
3. 母种培养基和原种培养基简法灭菌创新技术
3.1 灭菌设备：
母种培养基和原种培养基简法灭菌创新技术选用的灭菌设备为“苏泊尔”压力锅，即家庭做饭用的压力锅，又称家用高压锅。
3.2 灭菌操作：
向“苏泊尔”压力锅内注水5厘米深，将制备好的食用菌母种、原种培养基分别直立于压力锅内，盖上锅盖，生火灭菌40分钟～50分钟即可。
小结：该技术突破了传统方法需要用牛皮纸包扎试管口或瓶口棉花塞，全封闭高压灭菌却仍不能保证100%不湿棉花塞的难题，达到了不用专用高压灭菌锅，不用高档灭菌设备，不包扎棉花塞全裸露灭菌却100%不湿棉花塞的理想效果。
其突出的特点是灭菌设备为家用炊具，可一锅多用，且价廉易购，灭菌方法简单实用，灭菌效果好。
彻底解决了食用菌母种和原种制作难、消毒灭菌更难的技术难题，为食用菌种简法生产开拓出新天地。
