透射电镜样本的制备共42页文档

第二节透射电镜样品的制备一、表面复型和萃取复型技术（一）复型样品成像原理复型样品是一种间接试样，是用中间媒介物（碳、塑料薄膜）把样品表面浮雕复制下来，通过对浮雕的观察间接地得到样品表面组织形貌。

一定能量的入射电子照射到样品上要受到样品内原子核与核外电子的作用，产生弹性散射与非弹性散射。

非晶体复型样品成像主要取决于入射电子与试样中原子相互作用所产生的电子散射。

电子束穿过样品时在样品厚的区域或原子序数大的区域受散射程度大，反之则小。

这就是所谓的质厚衬度效应。

如果在样品下方加一光阑，那么散射角大于光阑孔径角的电子被光阑挡住或吸收，而不能穿过光阑孔参与成像。

散射角小于或等于光阑孔径角的电子就能穿过光阑孔参与成像，因此在荧光屏上就形成了明暗不同的衬度，产生了样品的图像。

图5—10为复型样品成像示意图。

（二）复型样品制备技术1．对金相试样的要求电镜的高分辨本领使它能够显示出金属组织的微细特征。

为使组织微细特征不在制备试样时失真，对图5—10 复型样品成像示意图金相试样的制备要求严格。

否则会造成假像影响对观察结果的分析。

试样要细心磨制，仔细抛光，力求避免产生微小的磨痕及变形层。

浸蚀剂与做金相试样时所用的浸蚀剂相同，浸蚀应浅些，这样可保留组织细节。

如果浸蚀过重就可能引起相界、晶界的过浸蚀，导致失真、脱落，甚至会出现腐蚀坑等假象。

2．AC纸的制作AC纸就是醋酸纤维素薄膜，是用6%醋酸纤维素丙酮溶液制作的塑料薄膜。

为了使AC 纸质地柔软、渗透性强并具有蓝色，在所配制的溶液中再加入2%磷酸三苯脂和几粒甲基酯。

待醋酸纤维素在丙酮中溶解后将其倒在干净、平滑的玻璃板上，倾斜转动玻璃板，使溶液均匀展开。

然后用玻璃钟罩扣上，让钟罩下边与下板间留有一定间隙以便于丙酮挥发。

大约经过24小时后AC纸干透，用小刀片轻划AC纸边缘，小心揭下即可。

3．塑料—碳二级复型塑料—碳二级复型由于其制备过程不损坏金相试样表面，重复性好，供观察的第二级复型—碳膜导电、导热性好，在电子束照射下较为稳定，因而得到广泛的应用。

¾透射电子显微镜成像时，电子束是透过样品成像。

¾由于电子束的穿透能力比较低，用于透射电子显微镜分析的样品必须很薄。

¾根据样品的原子序数大小不同，一般在50～500nm之间。

透射电镜样品的要求：¾1. 样品必须对电子束透明。

¾2. 所制得样品必须具有代表性，以真实反映所分析材料的特征。

主要方法：粉末样品、复型、离子减薄、电解双喷。

¾透射电镜观察用的样品很薄，需放在专用的样品铜网上。

¾透射电子显微镜使用的铜网一般直径为3毫米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品就承载在这种支撑膜上。

样品铜网的作用：¾承载样品，并使之在物镜极靴孔内平移、倾斜、旋转，寻找观察区。

¾样品通常放在外径3mm ，200目方孔或圆孔的铜网上，铜网牢固夹持在样品座中保持好的热、点接触，减少因电子照射引起的热或电荷积累而产生样品漂移或损伤。

样品台透射电子显微镜样品制备电镜观察时样品受到的影响：(1)真空的影响。

含有挥发溶剂或易升华的试样必须冷冻后观察。

(2)电子损伤的影响。

试样在电镜中受到l0－3～1A/cm2的电子束照射，电子束的能量部分转化为热，使试样内部结构或外形发生变化或污染。

观察有机物或聚合物试样时，为防止电子束对试样的损伤和污染，应提高电压。

(3)电子束透射能力的影响。

由于电子束透射能力较弱，一般100kv加速电压时，试样厚度必须在20～200nm之间。

粉末样品制备¾随着材料科学的发展，超细粉体及纳米材料发展很快，而粉末的颗粒尺寸大小、尺寸分布及形态对最终制成材料的性能有显著影响，因此，如何用透射电镜来观察超细粉末的尺寸和形态便成了电子显微分析的一的一项重要内容。

¾其关键工作是是粉末样品的制备，样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，使其均匀分散到支持膜上，各自独立而不团聚。

透射电镜样品制备方法透射电镜的样品制备方法，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞器自溶现象。

因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。

（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。

（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm，取样形状为牙签状。

也可将组织修成1mm*1mm*2-5mm大小长条形。

因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。

（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。

推荐使用手术刀或双面刀片。

（4）操作最好在低温（0℃—4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。

（5）取材部位要准确。

切片窗小于1mm*1mm，如取样带有太多的多余组织，可能造成你需要的部分刚好被修掉。

二．取材方法（按照自己的样品类型检索）1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5 ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官。

用手术刀切割取一小块组织，放在干净的硬质板上（例如培养皿底部），滴一滴冷却的固定液。

用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1 mm宽，3~5 mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条（牵拉损伤将直接破坏组织，切取时刀片下压，不要来回拉锯），用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5 ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）4小时或以上。

*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。

送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。

送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。

后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。

透射电镜样品制备引言透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope, 简称TEM)是一种非常强大的高分辨率成像技术，可以用于观察材料的结构和组织，以及研究纳米级别的材料特性。

在使用TEM进行实验之前，必须制备一种称为透射电镜样品的特殊样品。

透射电镜样品制备的关键是制备出足够薄的样品，以便电子可以通过样品而不会被散射或吸收。

本文将介绍透射电镜样品制备的常用方法和步骤。

方法1. 切割样品透射电镜样品通常需要从大块的材料或器件中切割出来。

首先，选择合适的切割工具，如金刚石刀片或钨丝刀，以确保能够切割出薄片。

然后，将待切割的材料固定在切割台上，并将其固定好。

使用切割工具沿着所需的方向切割材料，控制切割角度和速度，制备出较薄的样品。

2. 技术腐蚀技术腐蚀是一种常用的透射电镜样品制备方法，可以在保持样品形状和结构的情况下，去除样品表面的杂质。

首先，将样品放置在腐蚀液中，如酸性或碱性溶液中。

然后，根据所需的腐蚀速率和选择的溶液，控制腐蚀时间，使材料的表面逐渐溶解。

腐蚀完成后，取出样品并用纯水冲洗，最后用热空气干燥。

3. 离心旋涂法离心旋涂法是一种常用的制备透射电镜样品的方法，适用于制备薄膜和纤维样品。

首先，将待制备的样品溶液或悬浮液滴在旋涂机的旋盘中心。

然后，启动旋涂机，使旋盘高速旋转。

在旋涂过程中，液体会在旋盘边缘形成薄膜或纤维，而溶剂则会挥发掉。

当样品完全干燥后，取出样品即可。

4. 离子磨蚀离子磨蚀是一种制备透射电镜样品的高级方法。

它可以控制样品的厚度和形状，并在其表面形成平坦的区域。

首先，将样品放置在磨蚀仪中，并选择合适的离子束参数。

然后，启动磨蚀仪，使离子束磨蚀样品表面。

通过控制磨蚀时间和离子束能量，可以获得所需的样品厚度和表面平整度。

结论透射电镜样品制备是进行TEM实验的关键步骤之一。

通过选择合适的方法和技术，可以制备出足够薄的样品，以便电子能够透射而不被散射或吸收。

透射电镜样品制备方法透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种利用电子束穿透样品而观察样品结构的高分辨率显微镜。

为了获得高质量的透射电子显微镜图像，样品制备是非常重要的一步。

下面将介绍几种常见的透射电镜样品制备方法。

1.薄片制备法：薄片制备法是最常用的透射电镜样品制备方法之一、首先，将待观察的材料切割成薄片，通常使用切片机或者离心切片机进行切割。

然后，将薄片放置在网格上，并用显微镊夹持住。

接下来，使用离心机将网格和薄片一起离心，以去除多余的液体。

最后，将网格放入透射电镜中进行观察。

2.离解法：离解法适用于那些不易制备成薄片的样品。

首先，将待观察的样品制备成溶液或者悬浮液。

然后，将溶液滴在碳膜覆盖的网格上。

接下来，使用离心机将网格和溶液一起离心，使溶液在网格上均匀分布。

最后，将网格放入透射电镜中进行观察。

3.冻结法：冻结法适用于那些需要观察生物样品或者水溶液的样品。

首先，将待观察的样品制备成溶液或者悬浮液。

然后，在液氮中冷冻样品，使其迅速冻结成冰。

接下来，使用离心机将冰冻样品离心，以去除多余的液体。

最后，将网格放入透射电镜中进行观察。

4.脂溶法：脂溶法适用于那些不溶于水的样品。

首先，将待观察的样品制备成脂溶液。

然后，将脂溶液滴在碳膜覆盖的网格上。

接下来，使用离心机将网格和脂溶液一起离心，使脂溶液在网格上均匀分布。

最后，将网格放入透射电镜中进行观察。

除了以上几种常见的透射电镜样品制备方法，还有一些特殊的方法，如原位制备法、离子切割法等。

这些方法可以根据实际需求选择使用。

总结起来，透射电镜样品制备是透射电子显微镜观察样品结构的关键步骤。

合适的样品制备方法可以保证获得高质量的透射电镜图像。

不同的样品制备方法适用于不同类型的样品，研究人员可以根据实际情况选择合适的方法进行样品制备。

透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。

尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。

样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。

尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。

②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。

操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。

二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。

广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。

一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。

超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。

但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。

具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。

要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。

③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。