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实验名称：坐骨神经—腓肠肌标本的制备一、实验目的学习坐骨神经—腓肠肌标本的制备方法，掌握基本操作技术。
二、实验原理1、牛蛙作为实验动物的优势容易饲养，产量丰富价格便宜，性价比高。
蛙或蟾蜍等两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与哺乳动物相似，如神经的生物电活动、肌肉收缩等。
牛蛙是哺乳动物的理想替代品。
牛蛙的离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握。
在任氏液的浸润下神经肌肉标本可较长时间保持生理活性。
2、使用锌铜弓检验标本活性的原理锌铜弓是把一根锌棒和一根铜棒一端焊在一起，另一端分开。
锌的金属电势比铜低，形成一定的电势差（就相当于有电压）。
细胞的静息膜电位为外正内负，电刺激可改变可兴奋细胞的膜电位差。
膜电位减小时，细胞去极化。
细胞兴奋，膜电位增大时，细胞超极化，细胞兴奋性被抑制。
当用锌铜弓接触标本时，可产生沿锌片—活组织—铜片流向的电流对细胞产生刺激效应。
引起标本局部去极化，引发动作电位，肌肉收缩。
三、实验器材1、实验动物：牛蛙。
2、实验器材：任氏液，蛙类手术器械一套，大头针，锌铜弓。
四、实验流程和步骤1、实验流程洗干净实验动物→毁髓→剥制后肢→分离两后肢→分离坐骨神经→游离腓肠肌→分离股骨头→标本检验2、实验方法与步骤（1）毁髓：一只手握住牛蛙，使其背部向上。
用拇指压住牛蛙背部，食指压其头部前端，另一只手持毁髓。
用解剖针从蛙的枕骨大孔（把头抬起来时凹陷的部位或者脊柱与头骨的中心点）插入向前搅动后再向后搅动，直至毁髓成功（蛙的四肢自然下垂，瘫软无力）。
（2）剥制后肢标本：轻提双毁髓蛙，自背面耻骨联合上方约 1 公分处用粗剪刀横向剪断脊柱。
轻轻托起后肢，看清坐骨神经位置。
沿脊柱两侧横向切口剪断体壁、去除断口以上肢体和内脏放入污物缸。
剥去后肢皮肤后放入任氏液中备用。
（3）分离两后肢：用粗剪刀纵向剪开脊柱，并剪断两后肢相连的肌肉。
一只用于剥制标本，另一只放入任氏液中保存。
（4）分离坐骨神经、将后肢二标本脊柱端腹面向上、趾端向外侧用蛙钉将标本固定在蛙板上。
坐骨神经-腓肠肌标本制备骨骼肌单收缩及其总和以及Powerlab实验系统的使用二、实验目的：1. 学习蛙类动物单毁髓与双毁髓方法，并掌握坐骨神经-腓肠肌标本的制备方法。
2. 了解电刺激的极性法则和方法，学习肌肉收缩的记录方法。
3. 观察刺激强度与肌肉收缩反应的关系、骨骼肌的单收缩过程和肌肉收缩的总和以及强直收缩现象, 了解肌肉收缩过程的时相变化以及刺激频率对骨骼肌收缩形式的影响。
三、实验原理：腓肠肌由许多肌纤维组成，刺激腓肠肌时，不同的刺激强度会引起肌肉的不同反应。
当刺激强度过小时，不引起肌肉发生收缩反应，此时的刺激为阈下刺激。
而能引起肌肉发生收缩反应的最小刺激强度，为阈刺激。
当全部肌纤维同时收缩时，则出现最大的收缩反应。
这时，即使再增大刺激强度，肌肉收缩的力量也不再随之加大，该刺激强度为最适刺激强度。
肌肉组织对于一个阈上强度的刺激，发生一次迅速的收缩反应，称为单收缩。
单收缩一般要经历潜伏期、收缩期和舒张期三个过程。
当同等强度的连续阈上刺激作用于标本时，则出现多个收缩反应的叠加，叫做强直收缩。
当后一收缩发生在前一收缩的舒张期，即发生不完全强直收缩；当后一收缩发生在前一收缩的收缩期，各自的收缩则完全融合，肌肉出现持续的收缩状态，即产生完全强直收缩。
四、实验材料：青蛙五、实验步骤：1. 制备坐骨神经-腓肠肌标本：1) 洗干净实验动物2) 双毁髓，剥制后肢，分离两后肢3) 分离坐骨神经4) 游离腓肠肌5) 分离股骨头6) 标本检验7) 电刺激极性法则的验证2. 连接实验装置：将换能器的输出线接至RM6240生理记录装置的2通道，电刺激信号接至肌槽的电极上。
然后把制备好的坐骨神经-腓肠肌标本股骨固定在肌槽上。
将固定肌肉的棉线另一端接在张力换能器上，保持适度松紧，将坐骨神经搭在肌槽的电极上。
3. 设置通道放大器和刺激器：1) 打开PowerLab电源，检查USB线连接2) 打开Chart5中文版3) 设置通道数为24) 设置通道2-桥式放大器：量程5mV,低通10Hz，调零5) 设置刺激器：刺激方式选脉冲，脉冲数1，手动方式，量程10V,振幅100mV,标记通道1，频率1Hz,持续时间1mS,4. 开始测试：1) 打开刺激器面板和点右下角”开始“按钮2) 点右上角调节采样速度（“走纸速度”）3) 菜单打开设置刺激器的脉冲数2个或5个，重新打开刺激器面板4) 调节走纸速度为400六、实验结果：图1. 蛙坐骨神经—腓肠肌标本图（二）坐骨神经-腓肠肌标本在Powerlab实验系统中所记录下的数据1.通过不断调整刺激强度，使肌肉收缩的幅度适中，记录单收缩的曲线（图2-1 ）。
实验一 坐骨神经腓肠肌标本制备【实验目的】掌握坐骨神经腓肠肌标本的制备技术，为以后有关实验打下基础。
【实验原理】两栖类的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似， 而其离体组织所需的生活条件 比较简单，易于建立、控制和掌握。
因此在实验中常用蟾蜍或蛙的坐骨神经腓肠肌标本来观 察兴奋与兴奋性的一些规律以及骨骼肌的收缩特点等。
所以坐骨神经腓肠肌标本的制备是生 理实验的一项基本操作技术。
【实验对象】蟾蜍或蛙。
【实验材料】两栖类手术器械 1套(粗剪刀、组织剪、眼科剪、组织镊、眼科镊、金属探针、玻璃 分针、蛙板)、手术线、蛙尸缸、滴管、平皿、锌铜弓、任氏液。
【实验步骤】1． 破坏脑和脊髓取蟾蜍 1 只，用自来水冲洗干净。
左手握住蟾蜍，用拇指按压背部，食指按压头部 前端使其头部前俯，右手持金属探针在头前缘沿正中线向尾端触划，所触划到的头部后 端的凹陷处，即为枕骨大孔所在部位。
在此处将金属探针垂直刺入皮肤，有突破感后再 将金属探针折向前经枕骨大孔刺入颅腔，左右搅动捣毁脑组织；然后将金属探针回抽至 枕骨大孔处，转向后刺入脊椎管，反复提插捣毁脊髓。
此时如蟾蜍的四肢松软，呼吸运 动消失，表示脑和脊髓已完全破坏，否则应按上法再行捣毁。
2． 剪除躯干上部及内脏如图 1－1 所示，在骶髂关节位置用左手将蟾蜍提起，在骶髂关节水平以上 0.5～l 厘米处用粗剪刀剪断脊柱，然后将粗剪刀尖向下深入体腔沿躯干两侧剪开皮肤，使蟾蜍 头、上肢与内脏自然下垂，将其一并剪除弃去，仅留后肢、骶骨、脊柱及紧贴于脊柱两 侧的坐骨神经。
在整个剪除过程中注意勿损伤神经。
3． 剥皮左手用组织镊夹紧或用手直接捏住脊柱断端(注意：不要夹住或接触神经)，右手捏，将标本放在盛有任氏液 住其上的皮肤边缘，用力向下剥掉全部后肢皮肤（见图 1－2）的平皿中。
将手及用过的粗剪刀、组织镊等全部手术器械洗净，再进行下述步骤。
4． 分离两腿用镊子从背位夹住脊柱将标本提起，剪去向上突出的骶骨(注意勿损伤坐骨神经)，然后沿正中线用粗剪刀将脊柱分为两半，并从耻骨联合中央剪开两侧大腿，然后将分离的两条腿浸于盛有任氏液的平皿中备用。
第九章实验内容实验1 坐骨神经-腓肠肌标本的制备【实验目的】掌握制备坐骨神经-腓肠肌标本的操作技术，为此后有关的神经肌肉实验打下基础。
【实验原理】蛙或两栖类动物的一些基本生命活动及生理功能与温血动物近似，而且其离体组织需要的生活条件非常简单，易于控制和掌握。
因此在生理学实验中，坐骨神经-腓肠肌标本是研究神经肌肉生理最常用的对象，经常用来研究神经肌肉的兴奋性、刺激与反应的规律、肌肉收缩的特点、兴奋性的周期性变化等。
【实验器材和药品】蛙类手术器械一套（金属探针1根，粗剪刀、眼科剪刀各1把，圆头镊子、眼科镊子各1把，玻璃分针2根），蛙板和玻璃板各1块，培养皿，滴管，废物缸、锌铜弓，丝线，棉花；任氏液。
【实验对象】蟾蜍或蛙。
【实验方法和步骤】1．破坏脑和脊髓（常用的有三种方法）(1) 俯式捣毁法：是最常用的方法。
以左手持蟾蜍，将其腹面朝向手心，前肢夹在食指和中指之间固定，后肢夹在无名指和小指之间固定，并用拇指按压蟾蜍头部使之下俯30~40度角；然后右手持金属探针沿蟾蜍头部的中线下划，可触及一凹陷处即为枕骨大孔（图9-lA）。
将探针从枕骨大孔垂直刺入1~1.5mm，再向前刺入颅腔，左右搅动（可感觉到探针与颅骨壁的碰击），破坏脑组织；再将探针退回至进针处，但不拔出而是转向后方刺入椎管，破坏脊髓。
(2) 仰式捣毁法：将蟾蜍仰卧于蛙板上，拉开下颌，右手持探针在颅底两眼之间向前下刺入颅腔，用探针在颅腔内向四周捣毁脑组织，然后将探针退至粘膜下，针尖向后平行刺入椎管内以破坏脊髓。
(3) 横断脊柱后捣毁法：左手持蟾蜍，右手持粗剪刀，在两腋窝稍下横断脊柱，然后在脊柱呈白色的脊髓断面处，向上插入探针破坏脑，再向下插入探针破坏脊髓。
以上方法破坏脑和脊髓成功后，蟾蜍出现四肢（尤其是后肢）瘫软，并常有尿失禁现象。
实验二坐骨神经－腓肠肌标本的制备一．目的和要求1．学习蛙类动物双毁髓的实验方法2．学习掌握坐骨神经－腓肠肌标本的制备方法3．了解急性离体器官，组织实验二．动物与器材1．动物：蟾蜍2．器材：常用手术器械（手术剪、手术镊、眼科剪、眼科镊、毁髓针、玻璃分针）、辣盘、锌铜弓、培养皿、蛙钉、滴管、烧杯、棉线3．试剂：任氏液――提供母液，需按1：10稀释三．原理把蟾蜍的腓肠肌和连同它相连的坐骨神经从体内剥离出来，制成“神经－肌肉”标本；如果在神经的游离端一侧轻轻的触动神经，或者通以适当的电流作为刺激，那么在经过一个极短的时间后，可以看到肌肉出现一次快速的缩收和舒张。
而且，只要刺激不造成组织的损伤，上述反应可以重复出现。
这说明，神经或肌肉表面受到刺激的点，一定产生了某种信号，他们沿着神经纤维或肌细胞传导，最后导致整个肌肉发生受挫。
按该信号的传导速度和可重复性分析，只能是电信号。
用近代精密的电测量设备，即可确定在神经被刺激的点产生了一个微弱的电信号，它以一定的速度传向肌肉，而肌肉的收缩则发生在这种电反应之后。
上述神经－肌肉标本实际是整个体内反射弧的一部分，后者在进行正常活动时，先由感受器细胞对外在环境变化进行跨膜信号传导，随后才发生电信号在传入和传出神经纤维上的传导和细胞间的信息传递。
而肌肉运动主要时由于产生的动作电位。
四．方法与步骤1．双毁髓：左手握蟾蜍，背部向上，用无名指和小指夹在其后肢，中指抵制前肢，食指按压其头部前端，拇指压住躯干背部，使头向前俯；右手持毁髓针，找到两耳后腺之间的凹陷处即枕骨大孔位置，垂直刺入约1～2mm，然后将针尖向前刺入颅腔，搅动数下，捣毁脑组织（可感觉针触及颅骨）。
此时为单毁髓动物。
再将毁髓针退回垂直刺入状态，扔留1～2mm的针尖位于枕骨大孔处，将针尖转向右方，与脊椎平行刺入椎管，捣毁脊髓。
只蟾蜍后肢瘫痪，不再动弹。
2．剥制后肢标本：将双毁髓的蟾蜍背面向上放于蜡盘上，左手拿眼科镊轻提起两前肢间背部的皮肤，右手持眼科剪横向剪开皮肤，暴露耳后腺后缘水平的脊柱。
课程名称：坐骨神经腓肠肌实验教研室：生理学教研室任课教师：朱亮授课章节：细胞的基本功能授课专业和年级：医疗06级
授课学时：4学时授课时间：
坐骨神经腓肠肌实验
一、坐骨神经腓肠肌标本制备
【实验原理与目的】
蛙类的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握。
因此在实验中常用蟾蜍或蛙的坐骨神经腓肠肌标本来观察兴奋和兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本生理现象和过程。
所制备坐骨神经腓肠肌标本是生理学实验中必须掌握的一项基本技能。
本实验目的在于学习破坏蛙类脑脊髓法，掌握坐骨神经腓肠肌标本的制备技术、并获得兴奋性良好的标本，为以后有关实验打下基础。
【实验对象】
蛙或蟾蜍。
【实验器材和药品】
1．器械蛙类动物手术器械一套，包括普通剪刀、小手术剪刀、镊子、探针、锌铜弓、玻璃分针、蛙板、玻璃板、固定针等。
2．药品任氏液。
3．其它瓷盘、培养皿、小烧杯、棉花、棉线、纱布、滴管等。
【实验步骤和观察指标】
1.破坏脑和脊髓取蟾蜍一只，用布包裹蟾蜍四肢躯干露出头部，用左手握住蟾蜍，并用食指按压头部前端，拇指按压背部，使头部前俯；右手持金属探针由头前端沿中线向尾方划触、触及凹陷处即枕骨大孔的所在。
将探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即入枕骨大孔，这时将探针尖端转向头方，向前探入颅腔内，然后向各方搅动探针，以捣毁脑组织。
如探针确在颅腔内，术者可感觉出针在四面皆壁的腔内。
脑组织捣毁后，将探针退出；再由枕骨大孔刺入，并转向尾方，与脊髓平行刺入脊管，以破坏脊髓。
脑和脊髓是否完全破坏，可检查动物四肢肌肉的紧张性是否完全消失。
拔出探针后，同一干棉球压迫针孔，以止其出血（见图3-1-1-1）。
另一方法是去脑后再捣毁脊髓。
2.剪除躯干上部及内脏在骶髂关节水平以上0.5~1cm处剪断脊柱。
左手握止蟾蜍后肢、用拇指压止骶骨，使蟾蜍头与内脏自然下垂，右手持粗剪刀（非手术剪），沿脊柱两侧剪除一切内脏及头胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经。
剪除过程中注意勿损伤坐骨神经。
3剥皮左手握紧脊柱断端（注意不要握住或压迫神经），右手捏住其上的皮肤边缘、用力向下剥掉全部后肢的皮肤（见图3-1-1-2 ）。
把标本放在盛有任氏液的培养皿中。
将手及用过的剪刀、镊子等全部手术器械洗净，再继续下面步骤。
图1 蛙类捉拿和捣毁脑髓的方法
A，B 剪除躯干上部和内脏 C 剥掉后背及下肢皮肤
图2 蛙类坐骨神经腓肠肌标本的初步制作过程4分离两腿用镊子夹住脊柱标本提起，背面朝上，剪去向上突起的尾骨（注意勿损伤坐骨神经）。
然后沿正中线用剪刀将脊柱和耻骨联合中央辟开两侧大腿，并完全分离。
将两条腿浸入盛有任氏液的培养皿中。
5制作坐骨神经腓肠肌标本
（1）分离坐骨神经取一条腿放置在蛙板上的玻璃片上，用一固定针将粗制标本的脊柱固定在蛙板上（腹面朝上），将下肢拉直并向外旋转趾蹼朝上，用固定针在跖? 骨部固定在蛙板上，用玻璃分针沿脊柱旁游离坐骨神经至尾骨处、再循坐骨神经沟（股二头肌和半膜肌之间的裂逢处），找出坐骨神经的大腿段，用玻璃分针仔细剥离，剪断坐骨神经的所有分支，并将神经分离直至膝关节处。
（2）分离腓肠肌用玻璃分针或镊子将腓肠肌跟腱分离，并穿线结扎。
在结扎远端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，以手术剪刀剪去其周围联系的组织，但保留腓肠肌起始点与骨的联系，唯须注意勿损伤支配该肌的神经分支。
（3）游离坐骨神经腓肠肌标本将该后肢股部所有肌肉从膝关节起沿股骨剥离并剪去，以粗剪刀在股骨上中1/3处剪断股骨，剪下一小段与神经相连的脊柱（约1~2个脊椎骨）在膝关节下将小腿剪掉，留下的即为坐骨神经腓肠肌标本。
（见图3-1-1-3）
其各部连接关系如下：
脊柱小块→坐骨神经→膝关节→腓肠肌→跟腱→线（连接张力换能器）
↓
股骨小段（固定于肌肉槽内的侧孔）
图 3 坐骨神经腓肠肌标本的精细制作过程
（4）检查标本的兴奋性用经任氏溶液润湿的锌铜弓轻轻接触一下坐骨神经，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，则表明标本的兴奋性良好，即可将标本放在盛有任氏液的培养皿中，以备实验用。
若无锌铜弓，亦可用中等强度单个电刺激作上述试验。
【注意事项】
1.沿脊柱中央把下半身剪为左右两大半时，要正中，否则会损伤坐骨神经。
2.神经分离需用玻璃分针，分离过程中操作必须精细，避免用金属器械碰夹神经，以免损伤。
同时要注意持针分离方向应由中心向外周，以免将神经上段撕伤。
坐骨神经
周围的组织和神经的小分枝，可用分针纯性分离或用剪刀逐步剪掉。
3.所用的器械要洁净，接触蛙皮肤，特别是蟾蜍皮肤的用具必须洗净后使用。
4.应经常用任氏液湿润标本，防止干燥。
【思考题】
1.你制备的坐骨神经腓肠肌标本的兴奋性如何？
2.根据个人体会，总结制备新鲜完整的坐骨神经标本过程中的注意事项和体会
二、刺激强度和骨骼肌收缩
【实验原理与目的】
活的神经肌肉组织具有兴奋性，能接受刺激发生兴奋反应。
但刺激要引起组织兴奋，其强度、持续时间和强度——时间变化率都必须达到阈值。
一般来说，兴奋性高的组织其阈值低，相反，兴奋性低的组织则阈值高，因此，阈值常作为衡量组织兴奋性高低的客观指标。
不同种类组织的兴奋性高低不同，同一组织的不同单位其兴奋性高低也不同。
例如腓肠肌是由许多肌纤维组成的，各条肌纤维的兴奋性高低并不相同。
实验中，采用单一方波电刺激直接（或通过神经间接）刺激腓肠肌时，如刺激强度太弱，则不能引起肌肉收缩，只有达到一定强度时，才能引起肌肉发生最微弱的收缩。
这种刚能引起最小反应的最小刺激强度称阈强度（或称强度阈值、简称阈值）。
刚达到阈强度的刺激称阈刺激。
这时引起的肌肉收缩称阈收缩。
以后随着刺激强度的增加，肌肉收缩也相应的逐步增大，这时刺激的强度超过阈值故称为阈上刺激。
当刺激强度增大至某一数值时，肌肉出现最大收缩反应。
此时如再继续增加刺激强度，肌肉收缩却不再增大。
这种能使肌肉发生最大收缩反应的最小刺激强度称为最适强度。
具有这种强度的刺激称为最大刺激。
最大刺激引起的肌肉收缩称最大收缩。
可见在一定范围内，骨骼肌收缩的大小决定于刺激的强度，这是刺激与组织反应之间的一个普遍规律。
本实验的目的是通过实验，使学生掌握阈刺激、阈上刺激和最大刺激的概念，了解刺激强度与反应大小的一般关系，并获得一份完整的曲线结果。
【实验对象】
蟾蜍或蛙。
【实验器材和药品】
1．仪器生物机能实验系统（生物信号记录分析系统）或二道生理记录仪、张力换能器、电刺激器。
2．器械蛙手术器械一套、肌动器、支架、双凹夹等。
3．药品任氏液。
【实验步骤和观察指标】
1.仪器装置准备好生物机能实验系统（生物信号记录分析系统）及张力换能器的记录装置（参见《常用实验仪器》）。
2.手术操作按实验一制备坐骨神经腓肠肌标本，并置于任氏液中泡浸10~15min。
将标本的股骨残端固定于肌动器的螺旋孔内，将跟键与张力换能器悬臂的着力点用丝线连接，通过调节丝线紧张度，使腓肠肌处于自然拉长的长度。
3. 观察与纪录调节生物机能实验系统中的程控刺激器从弱逐渐到强进行刺激（见该仪器介绍），观察指标与上述相同。
【注意事项】
1.每次刺激前如有肌肉收缩，则待肌肉收缩完全恢复至基线后，再进行下一次刺激，使每次肌肉收缩的曲线起点均在同一水平上。
2.每两次刺激之间要让肌肉休息半分钟，并用任氏液湿润标本，以保持良好的兴奋性。
【思考题】
1.骨骼肌的收缩与刺激强度之间的关系如何？
2.为什么在阈刺激和最大刺激之间，骨骼肌收缩会随刺激强度的增强而增强？
三、刺激频率和骨骼肌的收缩
【实验原理与目的】
收缩是肌肉兴奋的外在表现。
肌肉收缩有两种形式，即等长收缩和等张收缩。
给活的肌肉一个短暂的有效刺激，肌肉会发生一次等长或等张收缩，此称为单收
缩。
单收缩的全过程可分为潜伏期、收缩期和舒张期。
其具体时间和收缩幅度可因不同动物和肌肉以及肌肉当时的机能状态的不同而有所不同。
如蛙腓肠肌的单收缩共历时约0.12s，其中潜伏期约0.01s，收缩期约0.05s，舒张期约0.06s。
若给肌肉相继两个有效刺激，且使两个刺激的间隔时间小于该肌肉单收缩的总时程，则引起肌肉的收缩可以总和起来，出现一连续的收缩，称之为复合收缩。
当给肌肉一串有效刺激时，可因刺激频率不同，肌肉呈现不同的收缩形式。
如果刺激频率很低，即相继两个刺激的间隔时间大于单收缩的总时程，肌肉出现一连串的在收缩波形上彼此分开的单收缩。
若逐渐增大刺激频率，使后一个刺激总是落在前一个刺激引起的肌肉收缩的舒张期，肌肉则呈现锯齿状的收缩波形，称之为不完全强直收缩。
再增大刺激频率使后一个刺激总是落在前一次肌肉收缩的收缩期，肌肉将处于完全的持续的收缩状态，看不出舒张的痕迹，称之为完全强直收缩。
强直收缩的幅度大于单收缩的幅度，并且在一定范围内，当保持刺激的强度和作用时间不变时，肌肉的收缩幅度随着刺激频率的增大而增大。
本实验的目的在于观察刺激频率和肌肉收缩形式之间的关系，从而认识机体在自然状态下肌肉的收缩形式、产生机制及其生理意义。
