苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基的优化

苏云金芽孢杆菌高浓度液体发酵培养基的优化研究孙翠霞;弓爱君;闫海;姚伟芳;宋晓春【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2006(23)9【摘要】以葡萄糖和甘油作碳源进行苏云金芽孢杆菌液体发酵,其发酵效果明显优于原实验室优化培养基,680 nm处的吸光度增加了5～6倍,得到的高浓度培养基成分为:胰蛋白胨5.0g·L-1、酵母膏5.0 g·L-1、葡萄糖(或甘油)20 g·L-1、KH2PO4 0.3 g·L-1、Na2 HPO4 1.1 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1、FeCl2·6 H2O 0.02 g·L-1、CaCl20.02 g·L-1、EDTA 0.2g·L-1、微液1 mL·L-1,pH值7.2.用葡萄糖作碳源进行8 L发酵罐小试,发酵过程中菌体生长正常,工业发酵采用此培养基可以大大降低发酵成本.【总页数】2页(P38-39)【作者】孙翠霞;弓爱君;闫海;姚伟芳;宋晓春【作者单位】北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】TQ920;Q939【相关文献】1.杏鲍菇液体发酵培养基优化研究 [J], 李志涛;孙金旭2.枯草芽孢杆菌液体发酵培养基成分优化研究 [J], 阙斐3.桑黄液体深层发酵培养基优化研究 [J], 唐思煜;赵优萍;吴迪;蔡成岗;毛建卫4.北冬虫夏草菌丝体液体发酵培养基的优化研究 [J], 孟丽君;张玉萍;鹿有贵;王术荣;张玉梅;王芳5.姬松茸液体发酵培养基筛选和条件优化研究 [J], 侯宪文; 符瑞益; 徐林; 文少白因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

2000年2月第30卷第1期 西北大学学报(自然科学版)Journal of N o rthw est U niversity (N atural Science Editi on ) Feb .2000V o l .30N o.1 收稿日期:1999209214 基金项目:陕西省科技攻关项目(97K 032J 6) 作者简介:申烨华(19642),女,陕西延安人,西北大学博士生,从事生物大分子分离与纯化研究。

苏云金杆菌发酵培养基的研究申烨华1,孙 2,张粉艳2,李宝璋2(1.西北大学现代分离科学研究所;2.西北大学化学工程学系,陕西西安,710069)摘要:采用正交实验法研究了不同培养基对B t 2HD 1产毒能力的影响。

优选出的培养基为:发酵液芽孢数达511×109・mL -1,2%发酵液24h 致死3龄小菜蛾幼虫65%,48h 达89%,72h 达100%。

普通培养基对应值分别为6.0×108・mL -1和35%,83%,100%。

优选出培养基最佳碳氮比(C N )为2.0,最佳含固量为8%。

关　键　词:正交实验;苏云金杆菌;培养基中图分类号:Q 815 文献标识码:A 文章编号:10002274 (2000)0120032204 B t 菌发酵生产的杀虫剂是一种对环境无污染,对人畜无毒害,害虫难以产生抗药性,不杀灭害虫天敌,从而能有效防治鳞翅目农林害虫,粮贮害虫以及卫生害虫的微生物农药[1],有极良好的应用前景。

在B t 生产中,培养基成分、碳氮比(C N )及含固量对菌的芽孢数量和发酵终产物的杀虫活性即毒力有较大的影响[1]。

关于B t 菌培养基的研究已有很多[2,3,4],但是综合考虑碳源、氮源、C N 和含固量的工作未见报道。

因此,本实验采用正交实验法,综合研究了这些因素对B t 2HD 21产毒能力的影响,得出了B t 2HD 21菌株的优化培养基配方,为B t 2HD 21的生产提供必要的参考。

现代农业研究Modern Agriculture Research第26卷在农作物生产中，经常会发生虫害，与化学农药相比，微生物杀虫剂已成为全球农药产业发展的重点[1-2]。

其中苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其生长繁殖快，具有较强的适应性，易于人工培养，对直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目等多种农业害虫有很强毒杀作用，是目前世界上应用最广的细菌性杀虫剂。

本试验对苏云金芽孢杆菌产芽孢的培养配方和培养条件进行优化，旨在为苏云金芽孢杆菌菌剂的生产提供理论依据。

1材料和方法1.1试验材料苏云金芽孢杆菌WY-197菌株，为吉林农业科技学院生物与制药工程学院微生物实验室保藏菌种；牛肉膏蛋白胨斜面试管培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，分装试管，常规灭菌后备用；液体菌种培养基：不加琼脂，装入250mL 三角瓶中，每瓶装入量100mL，常规灭菌后备用；碳源基础培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L；氮源基础培养基：葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L；无机盐基础培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L。

以上培养基调pH 值为7.4-7.6。

1.2培养条件的优化培养温度设25、30、35、37、40℃五个水平，培养72h；培养时间设24h、36h、48h、60h、72h 五个水平；培养基初始pH 值设6.5、7.0、7.5、8.0、8.5五个水平。

对芽孢进行染色显微观察，对菌剂进行毒力测定，考查芽孢释放的最适培养温度、时间、pH 值。

1.3培养基质及配方的优化碳源、氮源、无机盐的单因素比较：在供试碳源基础培养基中，分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、马铃薯粉、玉米淀粉各10g/L；在供试氮源基础培养基中，分别加入酵母膏、蛋白胨、大豆（煮熟粉碎）、鱼粉（粉碎）、麦麸（粉碎）各10g/L；在供试无机盐基础培养基中，分别添加FeSO 4、KH 2PO 4、MgSO 4各4g/L，以及FeSO 42g/L+KH 2PO 42g/L、Fe-SO 42g/L+MgSO 42g/L、KH 2PO 42g/L+MgSO 42g/L。

苏云金杆菌液态发酵培养基的优化
廖湘萍;付三乔;易华蓉;杨翠珍
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2007(46)4
【摘要】对苏云金芽孢杆菌液体发酵法的培养基进行优化,确定其适宜的配方为4%葡萄糖,4%蛋白胨,2.5%酵母水溶性浸出物,0.5%无机盐混合.在此条件下,经过32 h 发酵后,还原糖0.49%,生物效价4 234.00IU·μL-1,晶体含量0.55%,菌体湿重
18.72%.
【总页数】2页(P571-572)
【作者】廖湘萍;付三乔;易华蓉;杨翠珍
【作者单位】湖北轻工职业技术学院,武汉,430070;湖北轻工职业技术学院,武
汉,430070;湖北轻工职业技术学院,武汉,430070;华中科技大学武昌分校,武
汉,430070
【正文语种】中文
【中图分类】S467+.11
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王鹏晓;方玉美
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5.生产纤溶酶液态发酵培养基中碳氮含量的优化 [J], 贾宁
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第２期杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化运用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ的中心组合设计原理，以最陡爬坡实验得到的中心点对Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验确定的３个显著性影响因子各取３水平．设计了３因素３水平共１５个实验点进行响应面分析．１．５芽孢量测定用石碳酸复红对待测菌液进行染色，芽孢未被染色，在显微镜下观察，血球计数板进行计数．２结果与分析２．１单因子实验２．１．１碳源单因子实验分别以玉米淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖为碳源，对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９进行发酵培养，结果表明５种碳源都能促进该菌的生长并产生芽孢．其中以玉米淀粉为碳源的培养基芽孢产量最多，结果见图１．从培养基原料的来源、价格和对芽孢产量的影响等方面考虑，确定以玉米粉、玉米淀粉作为发酵培养基的碳源．２．１．２氮源单因子实验以玉米淀粉作为碳源，分别以黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵、蛋白胨、黄豆粉作为初始氮源，进行单因子实验．在培养过程中苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９生长良好，各种培养基组合都有芽孢产生，但在芽孢产量上有所差别，结果如图２所示．可见酵母粉对芽孢的产量影响最大，本实验确定以酵母粉、黄豆饼粉作为培养基的氮源．２．２Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法筛选培养基巾影响发酵液芽孢产量的重要因子通过碳源和氮源单因子实验，结合其他召ｚ发酵实验过程中发酵培养基的组成以及碳氮源比例，确定初始发酵培养基为：玉米粉１０．０ｇ／Ｌ，玉米淀粉１５．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２０．０ｇ／Ｌ，酵母粉３．０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰ０４０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ。

·７Ｈ２００．２ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ。

０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ。

０．２ｇ／Ｌ．将初始发酵培养基巾的８个组分作为影响因素进行全面考察，选择８因子２水平的实图１不同碳源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响图２不同氮源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响验设计，以ｘ。

、咒、ｘ。

、Ｘ。

、ｘ，、ｘ。

、ｘ。

、ｘ。

分别代表玉米粉、玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、Ｋ：ＨＰＯ。

苏云金芽孢杆菌培养基优化及间歇发酵
关雄;陈锦权
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】1998(014)001
【摘要】对苏云金芽孢杆菌的培养基配方进行室内摇瓶优化筛选，首先用摇瓶培养筛选到Ⅱ号培养基，在此配方的基础上，将培养基组分划分为氨源、碳源及无机盐三因素，采用三因素二水平正交旋转组合设计的方法进行培养基优化组合研究，建立其芽孢产量依氨源、碳源、无机盐的呼应方面方程。

借助此方程获得响应最佳点即培养基各组分的最佳配比。

实验结果表明，该方法也苏云金芽孢杆菌培养基优化中十分简便、实用、快速的途径。

此外，对其间歇发酵
【总页数】6页(P75-80)
【作者】关雄;陈锦权
【作者单位】福建农业大学;福建农业大学
【正文语种】中文
【中图分类】TQ45
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响应面法优化苏云金芽胞杆菌YC10发酵培养基Optimization of Fermentation Medium of Bacillus Thuringiensis YC10 by Response Surface MethodologyCHENG Feixuea，SONG Zhiqianga，WANG Jianb，WANG Zhongyonga，CHENG Juea，ZHANG Deyonga*，LIU Yonga* （a.Institute of Plant Protection，b. Hunan Agricultural Economy and Regional Planning Research Institute，Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha *****，China）Abstract The optimization of fermentation medium for crystal protein production by strain YC10 of Bacillus thuringiensis was investigated. Firstly，four of the most significant influence factors were screened by the method of PlackettBunnan design as soybean meal，corn starch，CaCl2 and K2HPO4. Then，the optimal combined concentration and mutual effect of four factors were optimized by response surface methodology. Our results showed that the best medium composition was soybean meal 25.73 g/L，corn starch 12.57 g/L，CaCl2 0.25 g/L，K2HPO4 0.43 g/L，ZnSO4 0.20 g/L，MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.25 g/L and FeSO4 0.25 g/L.Key words Bacillus thuringiensis；media optimization；response surface methodology；parasporal crystals苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）作为一种安全的生物农药，是目前世界上开发应用最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于、林业、贮藏以及卫生等多种害虫的防治.Bt菌株的杀虫毒力取决于发酵液中伴胞晶体蛋白的产生.而其发酵培养基的组成成分不仅影响发酵时菌体生长，还直接影响菌株蛋白晶体蛋白的产量，从而决定其杀虫效果，特别是培养基中的碳源、氮源和无机离子的组成及其配比对伴胞晶体蛋白的产生影响极大.而目前生产中常用的Bt发酵培养基配方并不能适用于所有的Bt菌株，往往会出现因发酵培养基中组分及配比不恰当而使得Bt菌株的伴胞晶体蛋白含量不高，从而影响其杀虫效果，限制其在生产上的应用.所以进行Bt菌株发酵培养基组分的选择和配比优化对提高菌株伴胞晶体蛋白的产量极其重要.响应面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是一种优化生物过程的统计学实验设计方法，是简化实验过程、降低开发成本、优化实验条件、提高生产效率和解决生产实际问题的有效方法.目前国内外利用响应面分析法在微生物发酵培养基的筛选优化中取得了很好成效.Bt菌株YC10是一种对植物线虫具有较强杀虫作用的活性菌株，本研究采用PlackettBurman设计和响应面分析法，以发酵液中伴胞晶体蛋白含量作为评价指标，对该菌株的发酵培养基进行筛选与优化，以提高该菌株伴胞晶体蛋白产生量，从而提高其杀线虫效率，为该菌株的化生产及其在农业生产上的应用提供指导.1 材料和方法1.1 供试菌株苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）YC10菌株，为本实验室分离保存菌种.1.2 菌种培养方法将芽孢杆菌单菌落接种到装有60 mL NA培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min摇瓶培养10～16 h，取4 mL转接到装有100 mL基础发酵培养基的500 mL三角瓶中，相同条件摇瓶培养至镜检80%芽孢脱落时停止培养，作为发酵实验菌种备用.1.3 发酵效果检测伴胞晶体蛋白提取采用等电点法，含量测定采用Bradford法.1.4 发酵培养基的筛选Bt培养过程中，培养基成分中氮源、碳源、无机离子（锌离子、镁离子、钾离子、钙离子、亚铁离子、锰离子）质量浓度对伴胞晶体蛋白影响较大.培养基筛选优化各实验的处理都采用500 mL锥形瓶中装50 mL培养基，菌种接种量2%，200 r/min，30 ℃摇瓶培养96 h，以各处理所得伴胞晶体蛋白含量为响应值.1.4.1 PlackettBurman设计在查阅文献的基础上，根据BoxBehnken原理进行PlackettBurman设计，筛选对Bt伴胞晶体蛋白产生显著影响的培养基成分.实验设8因子、2水平（标记为+1，-1），12个处理（见表1）.各成分的质量浓度以Xn表示：黄豆饼（X1），玉米粉（X2），硫酸锌（X4），硫酸镁（X5），硫酸锰（X7），氯化钙（X8），硫酸亚铁（X9），磷酸氢二钾（X10），X3，X6和X11代表虚拟因子以减少实验误差.1.4.2 最陡爬坡实验在PlackettBurman实验基础上，利用最陡爬坡路径法对显著影响Bt菌株YC10伴胞晶体蛋白产生的因子进行最陡爬坡试验研究.以试验结果中概率值（Pvalue）小于0.05的黄豆饼、玉米粉、磷酸氢二钾和氯化钙4个培养基组分的质量浓度作为主要影响因子、5水平标记（-2，-1，0，1，2）进行最陡爬坡实验设计，以确定培养基中显著影响因子的浓度范围.1.4.3 响应面分析以最陡爬坡试验得出的实验结果为依据，进行BoxBehnken设计，用Design Expert软件对实验结果进行回归及误差分析，获得回归方程，并根据回归方程绘制响应面分析图，进而确定最佳培养基配方，求得最优值.1.4.4 实验验证用得到的最佳培养基配方进行3次平行实验，取得平均值，与预测值进行比较以验证模型的可靠性，进而得出最终优化结果.1.5 结果统计与数据分析实验结果统计以实验处理组的伴胞晶体蛋白含量为响应值，每次试验重复3次.PlackettBurman实验和响应面实验运用Design Expert 统计软件（Version 8.0.7.1，StateEase Inc.，USA）进行方差分析（ANOVA），F检验（Ftest）.2 结果与分析2.1 显著影响因子分析PlackettBurman实验设计结果表明，黄豆饼、玉米粉、磷酸氢二钾、氯化钙4个培养基组分对Bt菌株YC10产孢作用影响显著（P0.05），对伴胞晶体蛋白含量的影响从大到小依次为黄豆饼、磷酸氢二钾、玉米粉和氯化钙（表2）.2.2 显著影响因子最适宜浓度范围PlackettBurman实验分析结果可以看出，高水平的黄豆饼和玉米粉对Bt菌株YC10伴胞晶体蛋白的产生起促进作用，而高水平的氯化钙和磷酸氢二钾则对伴胞晶体蛋白生成产生抑制作用.因此在最陡爬坡实验中对4种显著影响因子的质量浓度进行了适当调整，以寻找能产出最高伴胞晶体蛋白量的培养基组分.最陡爬坡实验结果（表3）显示，能获得最高伴胞晶体蛋白量的培养基组分初步确定为黄豆饼25.0 g/L，玉米粉12.5 g/L，氯化钙0.25 g/L，磷酸氢二钾0.45 g/L.2.3 响应面法筛选最优培养基组分在爬坡实验基础上通过响应面法中的BoxBehnken方法对4种培养基成分进行最优筛选，以黄豆饼250 g/L，玉米粉12.5 g/L，氯化钙0.25 g/L，磷酸氢二钾0.45 g/L为中心点进行响应面实验设计与分析（表4和表5）.从表5中可以看到，该回归模型多元相关系数R2为0.973 2，表明仅有2.68%的变异不能由此模型进行解释；同时，回归模型P值小于0.000 1，表明模型显著.经回归拟合，得到二次多项式方程：Y=171.50+10.80A+3.46B-2.23C-5.61D-6.20AB+3.90AC+1.45AD+2.75BC-1.08BD-0.85CD-1665A2-13.37B2-8.90 C2-8.32 D2（其中Y为伴胞晶体蛋白质量浓度）.根据上述拟合回归方程做出响应面分析图，见图1～图6.从图1可以看出，当培养基中CaCl2为025 g/L，K2HPO4为0.45 g/L时，使黄豆饼从22.5 g/L增加到27.5 g/L，玉米粉从11.5 g/L增加到13.5 g/L，产生的伴胞晶体蛋白均呈现先增加后减少的趋势，曲面顶点为产生的伴胞晶体质量浓度最大值.同样，图2和图3也显示，随着黄豆饼和CaCl2以及K2HPO4质量浓度的增加，发酵液中伴胞晶体蛋白质量浓度都呈现出先增后减的趋势.而图4和图5以及图6响应面分析图曲面较平坦，说明在此浓度范围内，随着培养基浓度增加，发酵液中伴胞晶体蛋白浓度变化不大.同时，从图1到图6的等高线图可以看出，培养基4种组分中，K2HPO4与黄豆饼或玉米粉间交互作用显著，而K2HPO4与CaCl2之间不存在显著的交互作用.2.4 最优培养基组分验证以上回归模型预测结果表明，当培养基中黄豆饼、玉米粉、CaCl2与K2HPO4分别为25.73 g/L，12.57 g/L，0.25 g/L和0.43 g/L时，培养基达到最优，其发酵液产伴胞晶体蛋白最多，预测可达179.4 mg/L.为验证预测结果的可靠性，在培养基配方为黄豆饼25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl2 0.25 g/L，K2HPO4 0.43 g/L，ZnSO4 0.20 g/L，MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.25 g/L和FeSO4 0.25 g/L时，进行摇瓶发酵重复实验，实验结果显示伴胞晶体蛋白为178.2 mg/L（175.6～179.2 mg/L）.与预测值179.4 mg/L较接近，能很好地拟合模型，说明该模型有效.利用优化后的培养基进行YC10菌株发酵培养，与优化前发酵液中伴胞晶体蛋白最高值137.6 mg/L相比，提高了29.5%.3 结论和讨论在微生物发酵中，培养基的优化常采用单因素法和正交实验法.单因素法只是针对某一因素的影响，没有考虑培养基中多种成分之间的交互作用，很难获得最佳优化结果，同时，该方法也较费时费力.正交实验虽然可以考虑因子中的交互作用，但实验次数多，同时不能明确得到一个组分中所有因子和响应值之间的函数表达式，因此难以确定整个组分中各因子的最佳组合 .响应面分析法是一种集统计、数学和计算机多学科的用于因子优化的综合性方法，常用于研究多因子系统中各因子交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件.Sumant等人利用响应面分析法对一株产碱性蛋白酶的芽胞杆菌发酵培养基进行优化，使其碱性蛋白酶产量提高了 2.6倍.本研究通过PlackettBurman实验设计，快速有效地从8个能影响Bt产生伴胞晶体蛋白的因子中筛选出4个显著性影响因子.利用最陡爬坡实验法确定了4种重要影响因子的质量浓度范围，并结合响应面分析法快速确定了培养基最佳浓度组合：黄豆饼25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl2 0.25 g/L，K2HPO4 0.43 g/L，ZnSO4 0.20 g/L，MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.25 g/L和FeSO4 025 g/L.在最佳培养基组合下，Bt菌株YC10伴胞晶体蛋白产量可达178.2 mg/L，比优化前提高了295%，与理论预测值接近，说明利用响应面分析法进行Bt菌株YC10发酵培养基的优化是合理可靠的.有关Bt培养优化方面的研究已有不少文献报道，但基本都以发酵液中菌株生长浓度或孢子产量为评价指标[13～15]，进行发酵培养基或培养条件的筛选，而以Bt伴胞晶体蛋白产量为评价指标的相关报道很少.尽管Bt菌株发酵中芽胞的产生与晶体蛋白含量具有相关性，但是活芽胞数量却并不能反映出发酵液的毒力.Bt对害虫的毒杀作用取决于其产生的伴胞晶体毒素蛋白，伴胞晶体蛋白产量直接决定其杀虫效价.所以，利用发酵液中产生的伴胞晶体蛋白浓度作为培养基筛选优化的评价指标，能可靠地反映其毒力.伴胞晶体蛋白的产生直接受到培养基中碳源、氮源、盐离子等因素的影响，所以通过调整发酵培养基配方以提高Bt产生伴胞晶体蛋白的能力，对该菌株在农业生产上的应用具有重要意义.。