电转感受态细胞的制备

制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。

制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。

1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。

该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。

操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。

2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。

3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。

4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。

5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。

2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。

操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。

2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。

3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。

4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。

5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。

在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。

2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。

3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。

4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。

一、B.subtilis感受态细胞的制备与电击转化1、培养基GM：40 mL（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，3.6 g山梨醇pH=7.2；ETM：200mL电转缓冲液(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%甘油)：18g山梨醇,18.5g甘露醇,甘油；RM：10mL（LB+0.5 M山梨醇+0.38 M甘露醇）：0.9 g山梨醇，0.7 g甘露醇，LB液体培养基。

2个50ml离心管，灭菌。

2、枯草芽孢杆菌WB600感受态的制备1)在新鲜平板上挑取单菌落（小一点为好）接种于5mL的LB液体培养基中，过夜培养(12小时)；2)测量摇管内菌液的吸光值，控制好接种量，使接种完毕后培养基的吸光值在0.19~0.2 左右，培养基为5mLGM。

37℃，180r/min 培养至OD600=1.0(3-4h)左右；3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000r/min，8min，4℃离心收集菌体；4)用40mL预冷的电转缓冲液(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖)洗涤离心后的菌体，5000r/min，8min，4℃离心倾去上清，如此反复漂洗3次；5)将洗涤后的菌体重悬于500µl电转缓冲液中，每管分装60µl，即为制备好的枯草芽孢杆菌感受态细胞，放于-70℃冰箱中保存。

3、枯草芽孢杆菌WB600电击转化1)向预先制备好的60µl枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中加入6µl重组质粒，冰水浴保温5min，然后加入到预冷的电转杯(1mm)中，电击一次，电转仪设置：2.0KV，25µF，200 Ω，电击一次(持续时间4.5-5ms)；2)电击完毕后立即加入1mL复苏培养基RM（LB+0.5 M山梨醇+0.38 M甘露醇），反复吸打几次，将溶液吸出转移到1.5 mL的离心管中，37℃，180r/min，振荡培养复苏3-5h后。

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。

为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

转化效率为109～1010转化子/µg DNA。

3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。

（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。

（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。

（4）重复步骤（3）1次。

（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。

（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。

（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。

3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。

（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。

实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。

（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。

防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。

（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。

质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤实验原理：利用瞬间高压造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，有利于DNA 等大分子进入。

因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

109〜1010转化子M g DNA。

,-电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37 C 摇床培养过夜；2.取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37 C摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6 （约2.5-3 小时）；3.将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5m l离心管中，在冰上冷却10分钟；5.4C下3000g冷冻离心5分钟；6.弃去上清，加入1500^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7.4C下3000g冷冻离心5分钟8.弃去上清，加入750^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.4C下3000g冷冻离心5分钟10.加入20^ l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11 .立即使用或迅速置于-70 C超低温保存。

-质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤1.制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中加入250^ l Amp （100mg/ml） , 250 诉l X-gal （20mg/ml）, 25 l IPTG （200mg/ml）,混匀后倒入灭菌培养皿中；2.取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3.每管感受态细胞加入1^ l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；4.电转化仪选择1800V作为输出电压；5.将要转化的混合物加入预冷的 1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；6.立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；7.将细胞转入合适的培养管中37C培养1小时；8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；9.37C培养过夜，观察结果。

枯草芽孢杆菌电转化方案一、感受态细胞的制备1）从新鲜培养的平板上接种一单菌落至3 ml B2液体培养基中，试管（17×100 mm）。

2）250 rpm，37℃培养过夜（16 h）。

3）接种1.5 ml过夜培养的种子至150 ml（装于500ml的三角瓶中）新鲜的B2培养基中，200 rpm，37℃培养，至菌数达到约1×108 cells/ml。

4）将菌液转移至50 ml的离心管中，冰浴15 min，然后4℃，4,500 rpm，15 min，离心收集菌体。

5）弃上清，用30 ml冰冷的10%甘油重新垂悬菌体（轻轻吹打），冰浴15 min，然后4℃，4,500 rpm，15 min，离心收集菌体。

6）弃上清，用15 ml冰冷的10%的甘油垂悬菌体重悬菌体，冰浴15 min，然后4℃，4,500 rpm，15 min，离心收集菌体。

7）用2 ml 预冷的10%的甘油之中重悬菌体，细胞浓度～1×1010 cells/ml。

8）将感受态细胞分装于1.5 ml的离心管中，每份50 ul，超低温速冻之后，于-70℃保藏。

可以保持几个月不失效。

二、电转化1）冰上融化感受态细胞，然后在加入载体3 ul到感受态细胞中。

2）冰浴5min，加入到预冷的电击杯中，冰浴2min。

3）设置仪器参数。

4）电击。

5）电击完毕取出杯子并立即加入500 ul SMMP溶液，洗脱感受态细胞，加入到1.5ml离心管中，37℃，250 rpm，复苏1h。

6）涂布相应的LB抗性平板（Amp），37℃培养36～48 h。

三、溶液和试剂1）B2培养基：水解酪蛋白10 g，酵母粉25 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，K2HPO4 1 g，加900 ml去离子水，调pH值到7.5，定容至1 l，灭菌。

2）SMMP溶液：55 ml 2×SMM，40 ml 4×PAB，5 ml 10%(w/v)BSA，调pH值到7.0，过滤除菌。

电转化感受态细胞流程- 2005/09/21 23:141．电转化感受态细胞的制备1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。

（同时做培养基和枪头的空白对照）2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。

4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。

7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。

8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。

同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况，并记录。

2．连接产物纯化1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:10ul of ddH2O2ul of 3M NaAC（PH5.2）50ul of 无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，top Speed 离心30分钟；3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4.加入500ul70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，top Speed离心5分钟；6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；3.电转化1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。

大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。

在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。

因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。

感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。

2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。

•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。

3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。

电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。

2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。

3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。

以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。

感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。

制备感受态细胞的实验报告一、实验目的掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。

二、实验原理1.感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。

细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

化学制备法：大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

农杆菌电击感受态的制备，转化及验证1.制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

(2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡3-4小时，至OD560=0.5左右。

(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。

(4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。

(6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/管)备用。

2 农杆菌感受态的电转化〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。

(2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。

(3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。

(4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上，28℃培养2-3天。

其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入感受态制备及转化方案二1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。

电转感受态细胞的制备电转感受态细胞 (Electroporation-mediated transfection) 是一种通过电场作用将外源 DNA 或 RNA 导入细胞的技术，该技术广泛应用于基因功能研究、药物筛选、基因治疗等领域。

本文将介绍电转感受态细胞的制备方法、原理以及注意事项，帮助读者更好地理解该技术的应用和操作。

下面是本店铺为大家精心编写的5篇《电转感受态细胞的制备》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

《电转感受态细胞的制备》篇1一、电转感受态细胞的制备方法电转感受态细胞的制备方法主要包括以下步骤:1. 细胞培养：将细胞接种到培养皿或培养瓶中，利用含有营养物质的培养基进行培养，使其生长至适宜的细胞密度。

2. 构建表达载体：将目的基因或 siRNA 克隆至表达载体中，构建表达载体的过程需要考虑转染效率、选择合适的启动子、转录因子等。

3. 电转感受态细胞：将构建好的表达载体与细胞一起孵育，然后在一定强度的电场作用下将表达载体导入细胞内。

4. 筛选阳性细胞：通过抗生素抗性基因或荧光标记等方法筛选成功转染的细胞，获得电转感受态细胞。

二、电转感受态细胞的原理电转感受态细胞的原理是利用高强度电场作用下，细胞膜通透性增加，使得带电的分子 (如 DNA 或 RNA) 能够更容易地通过细胞膜进入细胞内部。

电转感受态细胞技术相比传统转染技术，具有高效、快速、简便等优点，且对细胞的毒性较小。

三、注意事项在进行电转感受态细胞制备时，需要注意以下几点:1. 细胞密度的控制：细胞密度过高或过低都会影响转染效率，一般适宜的细胞密度为 10^6-10^7 个/ml。

2. 表达载体的质量和浓度：表达载体的质量和浓度对转染效率有很大影响，通常需要在 1-10 μg/μl之间。

3. 电场强度和脉冲次数的控制：电场强度和脉冲次数对转染效率也有很大的影响，需要根据实验条件和细胞类型进行调整。

4. 细胞培养条件的控制：细胞培养条件对转染效率也有很大的影响，如温度、CO2 浓度、培养基成分等。

大肠杆菌感受态制备及电转化流程1.细菌电转化感受态细胞的制备准备：50mL离心管3个10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。

晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转速控制在200rpm；2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；3）将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管，然后至于冰水混合物中骤冷，一定要骤冷，冰水混合物中冷却至少15min（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）3）将离心管于4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；4）用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，再重复一次；5）再用10%甘油重复步骤4）两次，4000rpm离心10min，最后一次倒尽上清后，再用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100μL/支（一般，25mL起始培养物最终用200-250μL l0%甘油悬浮）；6）放入-80℃冰箱中速冻。

或者立即用于电转化。

注意：1）菌种最好是-80℃冻存的，活化后生长状态较好。

2）20ml培养过夜，振荡速度不要过高（一般应该是37℃，300rpm，6h，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在200rpm，可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）3）培养完毕后一定要骤冷，是培养物在短时间内迅速冷却。

冰水混合物中摇动瓶子，大约15min。

4）使用的器皿一点要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH 固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。

电转化法制备感受态细胞
转化是生物学中的一畭新领域，它可以将一种细胞转换成另一种细胞。

近来，研究人员主要依靠先进的分子转化技术将造血干细胞转化成感受态的细胞，从而实现增加新的生理功能。

转化是一个必要而艰巨的任务，许多步骤需要花费大量的时间和资源。

近期，一种叫做电转化的新方法正在被看作是细胞转化工作中一种更快更有效、并且操作简便的新工具。

电转化是一种独特的转化方法，与普通转化方法有很大的不同。

电转化可以在非常短的时间内实现细胞转化，而且操作也十分简单，仅需要一些冷冻技术和基本的实验技术就可以完成。

目前，电转化最常用的是将造血干细胞转化成感受态的细胞，以增加新的生理功能。

这一方法已经广泛应用于人体细胞研究中，可以用来调查细胞内的蛋白质、基因和细胞藻结构，这可以为临床研究提供有益的信息和指导。

电转化技术在细胞转化领域引起了一定的反响，因为它比传统的转化技术要更加简单快捷，并有很高的转化效率。

尽管研究还处于初期，它仍然有望为今后的细胞研究提供重大帮助。

专利名称：一种用于酿酒酵母电转感受态细胞的制备的重悬液及酿酒酵母电转感受态细胞的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：郭天玮,钟云鹏,李彦敏,杨平
申请号：CN201610687374.4
申请日：20160819
公开号：CN107760613A
公开日：
20180306
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用于酿酒酵母电转感受态细胞的制备的重悬液及酿酒酵母电转感受态细胞的制备方法，所述的重悬液包括5~15mM的甘氨酸‑NaOH缓冲液、占所述的重悬液总体积1~5%的乙二醇、占所述的重悬液总体积2~8%的二甲基亚砜、0.5~1.5M的山梨醇。

本发明解决了现有技术中的酿酒酵母电转感受态细胞不可冻存的问题，本发明中的酿酒酵母电转感受态细胞冻存后效价衰减较弱，能够满足实验需求，从而能够长期冻存，无需现配先用。

申请人：苏州泓迅生物科技股份有限公司
地址：215123 江苏省苏州市苏州工业园区星湖街218号生物纳米园C20栋1楼
国籍：CN
代理机构：苏州创元专利商标事务所有限公司
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电转化感受态细胞制备1．从新鲜培养基挑取一个大肠杆菌单菌落，接种与含50mlLB培养液的锥形瓶中，于37℃摇动（250rpm）培养过夜。

2．接种两份25ml的过夜培养物分别到盛有500ml预热LB培养基的2L锥形瓶中，37℃摇动（300rpm）培养，每隔20min测量一次OD600值。

3．当OD600值达到0.4时，迅速将培养物置于冰浴中15-30min不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。

离心管置于冰浴上预冷。

4．将细菌转移至冰冷的离心管中，4℃用SorvallGSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心15min。

倒去培养基，用50ml冰冷的纯水重悬。

5．4℃用Sorvall GSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心20min。

倒去培养液，用250ml冰冷的10%甘油重悬。

6．4℃用Sorvall GSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心20min。

倒去培养液，用10ml冰冷的10%甘油重悬。

7．4℃用Sorvall GSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心20min。

倒去上清，吸取管壁上的残留液体。

加1ml冰冷的GYT培养液重悬。

8．100倍稀释上述悬液后测OD600。

用冰冷的GYT培养液将其稀释至浓度为2×1010-3×1010个细胞/ml。

9．将40μl上述悬液转移到冰冷的电转化仪的电击杯中，检查电击时是否有短路现象。

如果有，那么剩下的细胞悬液用冰冷的GYT培养液洗一次，使细菌悬液的电导足够低。

10．将悬液分成40μl/管，封紧管口，液氮速冻，储存于-70℃。

GYT：10%（v/v）甘油，0.125%（m/v）酵母粉，0.25%（m/v）蛋白胨。