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噬菌体抗体库的构建流程一、获取抗体基因来源。
这可是构建噬菌体抗体库的第一步呢。
咱得先找到抗体基因从哪儿来呀。
一般来说呢，可以从免疫后的动物或者人的淋巴细胞里获取。
比如说，给小老鼠打了某种抗原，然后过一段时间，从小老鼠的脾脏或者淋巴结里把淋巴细胞分离出来。
这就像是去寻宝，淋巴细胞里就藏着咱们要的抗体基因这个大宝贝呢。
二、提取mRNA。
有了淋巴细胞，下面就得把里面的mRNA弄出来啦。
这个mRNA可重要了，它就像是抗体基因的信使。
我们要用特殊的方法，就像用一把很精细的小镊子，把mRNA从淋巴细胞这个大集体里挑出来。
这个过程可得小心点儿，就像呵护小幼苗一样，因为mRNA很容易被破坏掉呢。
三、反转录合成cDNA。
把mRNA弄出来之后呀，就得把它变成cDNA啦。
这就像是一场神奇的魔法，mRNA 的信息通过反转录酶这个魔法棒，变成了cDNA。
这个cDNA就相当于抗体基因的另一种形式，但是它更稳定，方便我们后面的操作。
四、扩增抗体基因片段。
有了cDNA，还得把抗体基因片段扩增出来。
这就好比是把一个小种子变成一大片花海的过程。
我们可以用PCR技术来做这件事。
这个技术就像一个超级复印机，能把我们想要的抗体基因片段复制好多好多份，这样我们就有足够的材料来构建抗体库啦。
五、构建重组载体。
接下来呢，要把扩增好的抗体基因片段放到一个载体上。
这个载体就像是一辆小卡车，把抗体基因片段运到噬菌体这个大工厂里。
我们要把载体和抗体基因片段连接起来，这个过程就像搭积木一样，得小心翼翼地让它们完美结合。
六、将重组载体导入噬菌体。
把重组载体构建好之后，就该把它送到噬菌体里去啦。
这就像把货物装上卡车，然后让卡车开到目的地一样。
我们可以通过一些特殊的方法，让噬菌体接受这个带着抗体基因片段的重组载体，这样噬菌体就变成了一个小小的抗体生产车间啦。
七、筛选阳性噬菌体。
最后一步也很关键哦。
在众多的噬菌体里，我们要把那些成功表达了我们想要的抗体的噬菌体找出来，这些就是阳性噬菌体啦。
新疆双峰驼天然单域抗体库的构建及初步鉴定张清华;夏雪琴;克力比努尔·热合曼;李江伟【摘要】旨在构建新疆双峰驼天然单域抗体库,及从中快速筛选VHH抗体.采用两种不同的抗原(溶菌酶和cAb-HEWL23)用天然文库进行筛选,成功筛选到了相应的抗体,并融溶菌酶筛选的VHH抗体(A3-1,A4-1和A10-1)进行表达和初步的ELISA 检测.结果显示,A3-1和A10-1具有结合溶菌酶的能力.该方法简单方便、省时省力,可以快速从天然单城抗体库中筛选VHH抗体.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】5页(P151-155)【关键词】溶菌酶;噬菌体展示;单域抗体;VHH【作者】张清华;夏雪琴;克力比努尔·热合曼;李江伟【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046【正文语种】中文噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源蛋白随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
利用噬菌体展示技术构建的抗体库为筛选抗体提供了一个方便的平台。
由于它的简单性和实用性，噬菌体抗体库已经成功应用于抗体的基因改造，如筛选高亲和力的抗体，人源化抗体和肿瘤靶向性的抗体。
早期构建的scFv或Fab抗体库，需要大量抗体基因克隆于噬菌体或噬菌粒载体，所需库容量很大。
如Biolnvent构建1.5×1010的 n-CoDeRTM-Fab抗体库，Cambridge Antibody Technology和Crucell构建的scFv 抗体库容量分别＞1011和＞1010[1] ，如需构建天然文库难度还会增加，而且此技术在分离具有可溶性和功能的单域抗体很少成功。
抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定罗弋;庞华;李少林;曹辉;李淑杰;王树斌;樊春波【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2009(029)011【摘要】目的构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体.方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv).将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能.将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测.结果成功构建噬菌体单链抗体库.经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%.SDSPAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体.结论成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体.【总页数】6页(P1155-1160)【作者】罗弋;庞华;李少林;曹辉;李淑杰;王树斌;樊春波【作者单位】重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学附属第一医院核医学科,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;包头市中心医院肿瘤科,内蒙古包头,014040;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 [J], 周艳红;祭芳;丁衬衬;史建荣2.抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定 [J], 李铁军;李德全3.抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定 [J], 段朝晖;毛越苹;罗晓红;李民友;劳伟思;王英;朱振宇4.鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 [J], 裴世春;孙大庆;郭德军;宋薇;蒋琛5.全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库的构建及筛选鉴定 [J], 谢平丽;李官成;李艳东;周国华;李跃辉;郭锋杰;王甲甲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
#论著#文章编号:1007-8738(2009)02-0150-05Daudi 细胞系特异性Fab 噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定申咏梅1,2*,杨晓春3,董宁征4,白 霞4(苏州大学附属第二医院:1放免中心,2检验教研室,3磁共振室,江苏苏州215004;4江苏省血液研究所,苏州大学附属第一医院,江苏苏州215006)收稿日期:2008-06-30; 接受日期:2008-09-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(30400111);江苏省自然科学基金资助项目(BK2004041)作者简介:申咏梅(1969-),女,重庆人,副教授,医学博士Te:l 0512-********;E-m ai:l szs y m@yahoo .co *Corres pond i ng authorG enerati on ,screeni ng and prelim i naryi dentification of specific Fab phage an -ti body li brary agai nst D audi cell strai nSHE N Yong-m ei 1,2*,YANG X iao -chun 3,DONG N ing-zheng 4,BAI X ia41R adi o i m munoassay Cente r ,2D epart m ent of C linical L abo rato ry ,3D epart m ent o f M agnetic R esonance ,Second A ffiliated H osp ita,lSoocho w U niversity ,Suzhou 215004;4Ji ang su Institutie o fH em a -to l ogy ,F irst A ffiliated H ospita ,lSoochow U n i ve rsity ,Suzhou215006,Ch i na[Abstract] A I M:To gene ra t e and screen the specificFab p hage an ti b ody library aga inst human Daud i ce ll stra in in B-ly mphoma and i d en tify t he positive c l o nes .M ETH-OD S :BA LB /c m ice we re m i mun ized w it h Daud i ce lls ,and an tisera we re titra ted by EL I SA .Fo llo w ing t he demonstra -tion o f su fficien t an tibody tit e r ,to t a l RNA was extract ed from sp l e n ic ly mphocytes o f the m i m unized m i c e and RT -PCR w as used to am p lify J ligh t cha in and Fd fragmen ts o f heavy chain .A ft e r re strictive d igestion w ith S a c I/Xba I and X ho I/S pe ,I the J ligh t cha in and the Fd fragm ents were succes -sive ly inse rt ed in t o the p hagem id vector pComb 3H -SS and then e l e ctropo ra t ed in t o E.co li XL 1-B l u e .The spe cific Fab phage antibody li b ra ry aga inst Daud i ce ll stra i n in hu man B-l y m pho m a was constructed by in f ec tion o f he l p e r phage VC -SM 13.Fo llo w ing six rounds of b iopanning w ith Daud i ce lls ,the antigen b inding acti v ities o f rando m clone s we re t ested by EL I S A to se lect the positive c l o nes ,wh ich we re further DNA sequenced ,expre ssed i n E.co li X L 1-B lue and i d en t -i fi e d byW estern b lo.t RE SULTS :The Fab phage an tibody l -i b ra ry w it h 3.13@107size was construct ed and f our positive c lones wh ich spec ifica lly recogn ized Daudi ce ll stra in w ere -i so l a t ed .In am i n o ac i d seq uences ,the var i a b le heavy do -m ains (V H )we re found to be 80%-94%and va riab l e ligh tdom a i n s (V L )88%-95%homo logous w ith respective m u -r i n e ge r m line genes in GenBank .Fu rthe r mo re ,so lub l e Fab antibod ies o f t he po sitive clone s we re successfu ll y ex -p ressed in E.c o l i XL 1-B l u e and t he reactivity w ith t he memb rane p ro t e ins o f Daud i ce lls wa s demonstra t ed by W estern b l o .t CONCLUSI ON :Fab phage an ti b ody library is succe ssfu lly constructed and specific an tibod ies aga instmemb rane antigens in Daud i ce lls are ob ta ined ,wh ich pro -vides an expe rm i en t a l f ounda tion for the further i n ve stiga tion o f B -ly m phoma m i munotherapy .[K ey w ords]B-ly mphoma ;Fab ;Phage anti b ody li b ra ry ;Daud i ce ll stra i n ;pComb 3H -SS vector[摘要] 目的:构建针对B 细胞淋巴瘤D aud i 细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定。
人呼吸道合胞病毒的检测、分离及鉴定的开题报告一、选题背景人呼吸道合胞病毒是一种了解程度较少的病毒，主要引起儿童呼吸道感染性疾病，如婴儿流感、儿童肺炎等，病情轻则仅呈现感冒症状，严重者可导致呼吸衰竭甚至死亡，对儿童的健康具有重要影响。
因此，对于人呼吸道合胞病毒的检测、分离及鉴定等方面的研究十分必要。
二、研究目的1.深入了解人呼吸道合胞病毒的基本特征。
2.开展人呼吸道合胞病毒的检测、分离及鉴定工作，为临床诊断、疫情防控提供基础数据。
三、研究内容1.人呼吸道合胞病毒的基本特征研究采用实验室的基础技术和方法，包括荧光显微镜、电子显微镜、逆转录-聚合酶链反应等，研究人呼吸道合胞病毒的基本特征，探究其生物学特性、基因组结构等特点。
2.人呼吸道合胞病毒的检测研究采用逆转录-聚合酶链反应等技术方法，对临床患者或肺标本中是否存在人呼吸道合胞病毒进行检测研究，并对检测方法进行优化。
3.人呼吸道合胞病毒的分离研究收集患者样本，运用胃苷酸辅助的PCR技术等方法对人呼吸道合胞病毒进行分离研究，建立人呼吸道合胞病毒的初步分类库。
4.人呼吸道合胞病毒的鉴定研究通过荧光免疫法、同步荧光抗体法等方法，对分离出的人呼吸道合胞病毒进行鉴定，对其亚型进行分析研究。
四、预期成果1.深入了解人呼吸道合胞病毒的基本特征，为疾病的防治提供理论基础。
2.建立人呼吸道合胞病毒的检测和分离方法，为人呼吸道合胞病毒的早期检测和诊断提供技术支持。
3.对人呼吸道合胞病毒的鉴定和分类得到初步研究，对其比较和分析，为今后开展相关研究提供参考。
五、研究意义通过本研究对人呼吸道合胞病毒的检测、分离和鉴定研究，可以加深对该病毒的了解，为其临床诊断、疫情防控及疾病治疗提供有力支持，有助于丰富人呼吸道病毒等呼吸道病原菌的研究内容，促进呼吸道疾病防治水平的提高。
二结果与分析（一）总ＲＮＡ的提取提取人外周血淋巴细胞总ＥＮＡ，经１％琼脂糖凝胶电泳后可见２８Ｓ和１８Ｓ两条清晰条带（图４），表明提取的总Ｐ，ＮＡ完整性较好，可作为模板进行转录。
图４淋巴细胞提取总ＲＮＡＦｉｇ．４日ｅ曲ｏｐｈｏｒｅ５ｉｓｏｆｔｏｔａｌＲＮＡ白ｏｍｌｙｍｐｈｏｃｙｔｃｓＭ：ＤＬＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）（二）ＰＣＲ扩增重链（Ｆｄ）和轻链（、＿，ＣＬ）基因以ｃＤＮＡ第一链为模板，以轻链和重链Ｆｄ段特异性引物的不同组合进行ＰＣＲ扩增轻链基因和Ｆｄ，１％琼脂糖凝胶上电泳显示，纯化的轻链和Ｆｄ段扩增产物于７００ｂｐ左右处可见较亮的特异性条带（图５，６）。
图５纯化的轻链基因ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．５ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｃｈａｉｎＭ：ＤＬＭａｒｋｅｒｆＤ屯２０００）Ｌｉ∞ｌ－７：Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ±７００ｂｐｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄ圈６纯化的重链侧）基因ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．６ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｄｆｓａｇｍｅｎｔＭ：ＤＬＭａｌｋｅｒ（ＤＬ２０００、Ｌｉｎｅｌ－８：Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ士７０曲ｐｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄ（三）噬粒ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ的鉴定自转化了ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ的大肠杆菌ＸＬｌ－Ｂｌｕｅ中提取质粒，以ＳｐｅＩ和ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ和Ｓａｃｌ分别双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳显示分别释放出３００ｂｐ和１２００ｂｐ外源片断（图７）。
圈７提取的噬粒ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ醇切电泳Ｆｉｇ．７ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｍｉｓｏｆｐＣｏｍｂ３ＸＳＳｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍ轧１－ＢｌｕｅＭＩ：ＤＬＭａｒｋｅｔ（ＤＬｌ５０００）Ｍ２：ＤＬＭａｚｋｃｒ（ＤＥ２０００）Ｌｉｎｅｌ－３：Ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳａｃＩａｎｄＸｂａＩＩＪｎｅ４－６：Ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳｐｃＩａｎｄＸｈｏＩ（四）轻链插入的鉴定随机挑取ＬＢ—Ａ（Ａｍｐｌ００／“ｇ／ｍ１）平板上１０个转化菌落，分别提取质粒后以ＸｂａＩ和Ｓａｄ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳显示，其中８个释放出７００ｂｐ左右的片段（图８），即相应质粒中有轻链基因片段，插入率为８０％。
鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用徐重新;张霄;张存政;刘媛;仲建锋;董飒;胡晓丹;林曼曼;刘贤金【摘要】构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料.从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因.采用重叠延伸PCR (SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库.以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性.以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性.经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76 μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上.经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因.电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×108.随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性.以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强.%A large phage display antibody library of mice for ScFvs screening and application research was constructed to obtain the independent intellectual property of the library.Extraction total RNAs from spleen cells of mice,then reverse transcribed them to cDNAs.Amplification of heavy chain gene (VH) andlight chain gene (VL)fragments with PCR,design two complementary Linker sequences and add to VH and VL respectively.Splicing VH-Linker and Linker-VL sequences by overlapping extension PCR (SOE-PCR) to a whole ScFv.Then clone ScFv into the pCANTAB-5E phagemid vectors,after being digested by restriction endonuclease (Not Ⅰ、Sfi Ⅰ) and linked by T4DNA ligase.Obtained primary phage display antibody library with over-night cultured that the pCANTAB-5E-ScFv recombinant plasmid introduced into E.coli TG1 by electroporation.The capacity of this library was calculated by monoclonal colonies.To analyze the diversity of thelibrary,the amino acid sequences of monoclonal colony phage ScFv in variable regions were alignment.We made Bt toxin proteins as coating antigen to verify its practicality by screening ScFvs which had antigen binding activity from the library.After detection,the total RNAs had clear bands an d its concentration was 2.76 μg/μl.We could clearly find bands of VH and VL by agarose gel electrophoresis and their complementary Linker genes were added respectively.Finally,the VH-Linker and VL-Linker were spliced to ScFvs by SOE-PCR and cloned into the pCANTAB-5E phagemid vector successfully.We obtained the primary phage display antibody library with a capacity of 3.67×108.By sequencing and sequence alignment of 12 monoclonal colonies phage ScFvs from random selection,we could determin the ScFv were from mice and the library had high diversity.After four rounds of panning in the library with three kinds of Bt (Cry1 B、Cry1 C、Cry1 F),the ScFvs which could combine with Cry1 B、Cry1 C、Cry1F were obtained.The results showed that this library had a stronger practicality.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2017(033)001【总页数】8页(P210-217)【关键词】噬菌体展示库;单链抗体;重叠延伸PCR;噬菌粒载体;Bt毒素【作者】徐重新;张霄;张存政;刘媛;仲建锋;董飒;胡晓丹;林曼曼;刘贤金【作者单位】江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】Q936噬菌体展示抗体库构建技术是伴随分子生物学、分子免疫学发展起来的新型基因工程抗体改造技术，是第3代抗体的重要载体[1-3]。
斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定摘要：以健康未经免疫的斑点叉尾鮰为试验材料，取其新鲜外周血，分离淋巴细胞，提取总ＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ。
ＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ，以纯化的ＶＨ、ＶＬ基因为模板，以与ＶＨ基因３′－端和ＶＬ基因－５′端序列互补的Ｌｉｎｋｅｒ—ＰｒｉｍｅｒＭｉｘ为引物，将ＶＨ、ＶＬ随机拼接为ＳｃＦｖ。
通过酶切连接，依次将ＰＣＲ产物插入质粒ｐ３ＭＨ相应位点，热激法转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，加入辅助噬菌体ＶＣＳＭ１３，构建噬菌体单链抗体库。
测定库容并酶切鉴定。
斑点叉尾鮰天然单链（SｃＦｖ）噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾鮰病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。
关键词：斑点叉尾鮰；抗体库；噬菌体展示；抗体单链（SｃＦｖ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ２５０ｍL ｂｌｏｏｄ，ｗｈｉｃｈｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍ５０ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｎｉｚｅｄｈｅａｌｔｈｙｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｉｒｖｅｎａｃａｕｄａｌｉｓ．ＴｈｅｈｅａｖｙｃｈａｉｎＦｄａｎｄｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｃｔｅｄｂｙＬｉｎｋｅｒ—ＰｒｉｍｅｒＭｉｘｉｎｔｏＳｃＦｖ．Ｔｈｅｎｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｌｉｇａｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙｉｎｔｏｔｈｅｐｈａｇｅｍｉｄｖｅｃｔｏｒｐ３ＭＨ，ｔｈｅｎｔｈｅｌｉｇａｔｅｄｓａｍｐｌｅｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉＸＬ１－Ｂｌｕｅ．ＴｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＶＣＳＭ１３ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅｔｏｙｉｅｌｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｈａｇｅSｃＦｖａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｎａiｖｅｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙｃｒｅａｔｅd ｆａｖｏｕｒａｂｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄａｂｓｔｒａｃｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＩｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓＲａｆｉｎｅｓｑｕｅ；ａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙ；ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｈａｇｅ；SｃＦｖ斑点叉尾鮰（ＩｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓＲａｆｉｎｅｓｑｕｅ）亦称沟鲶（Ｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈ），属于鲶形目（Ｓｉｌｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）鮰科（Ｉeｔａｌｕｒｉｄａｅ）鱼类。
抗体库的构建过程1. 引言抗体库（antibody library）是一种用于存储和筛选抗体的资源库。
通过构建抗体库，研究人员可以收集并保留大量的抗体样本，以便在需要时进行筛选和鉴定。
本文将详细介绍构建抗体库的过程，包括样本采集、抗体生产、抗体纯化和抗体标记等关键步骤。
2. 样本采集样本采集是构建抗体库的第一步，其目的是收集来源广泛、种类丰富的抗体样本。
常用的样本来源包括动物、人体和细胞培养物等。
2.1 动物样本采集动物样本采集是最常见的样本来源之一。
常用的动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
采集动物样本时，需要注意以下几点：1.选择健康的动物，确保其免疫系统正常；2.选择合适的采集方式，如血液采集、脾脏切片等；3.根据实验需要，选择不同时间点的样本，以获得不同抗体的变化情况。
2.2 人体样本采集人体样本采集是研究人员获取人体抗体的重要途径。
常用的人体样本包括血液、血清和组织等。
在采集人体样本时，需要遵守伦理法规，并征得被试者的知情同意。
2.3 细胞培养物样本采集细胞培养物可用于获得特定抗体。
在样本采集过程中，需要注意以下几点：1.选择适当的细胞类型，确保其具有抗体的表达能力；2.采用合适的培养条件，如温度、培养基组成等；3.选择合适的收获时间点，以获得丰富的抗体产量。
3. 抗体生产抗体生产是构建抗体库的关键步骤之一。
抗体可以通过多种方法进行生产，包括动物免疫、细胞培养和重组技术等。
3.1 动物免疫法动物免疫法是最传统的抗体生产方法之一。
它通过将目标抗原注射到动物体内，刺激其免疫系统产生相应的抗体。
具体步骤如下：1.选择适当的动物，如兔子、小鼠等；2.设计合适的免疫方案，包括抗原的剂量、注射次数等；3.在免疫完成后，采集动物血液，获得免疫血清。
3.2 细胞培养法细胞培养法是一种常用的抗体生产方法。
通过将抗原加入细胞培养物中，刺激细胞产生抗体。
具体步骤如下：1.选择适当的细胞类型，如B细胞、淋巴细胞等；2.将抗原加入细胞培养物中，培养一定时间以促进抗体产生；3.收集培养物，分离和纯化抗体。
噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选董金华;唐玉海;乔宁;韩金宏;董美华;董益阳【摘要】利用小白鼠免疫和噬菌体展示技术构建了噬菌体展示抗体文库,从文库中筛选获得了一株抗克伦特罗单克隆抗体.该抗体的氨基酸序列尚未在世界基因数据库中登录,是一个新的抗体.该抗体对于游离克伦特罗的半抑制率IC50为0.602μg/mL.该噬菌体展示的抗体片段可以用于竞争法检测克伦特罗的含量,其能够检测出的最低浓度为15.6 ng/mL,具有较大的实用价值.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】7页(P136-142)【关键词】克伦特罗;抗体;噬菌体展示;免疫检测【作者】董金华;唐玉海;乔宁;韩金宏;董美华;董益阳【作者单位】潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029【正文语种】中文盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLEN）是一种β2受体激动剂，属于拟肾上腺素类药物，分子量为313.7［1］。
20世纪80年代初，美国的一家公司发现盐酸克伦特罗可以明显地促进动物的生长，并能有效地增加瘦肉率［2］，它能够改变动物体内的代谢途径，促进肌肉特别是骨骼肌中蛋白质的合成，抑制脂肪的合成，从而加快家畜生长速度，相对增加瘦肉比例。
这一新发现很快被一些国家用于养殖业。
饲料中添加了盐酸克伦特罗后，可使猪牛羊等畜禽生长速度、饲料转化率及胴体瘦肉率提高10%以上，所以盐酸克伦特罗作为饲料添加剂一度被广泛使用。
但是后来科学家们发现人类过度摄入克伦特罗会引起巨大的不良反应，严重的可能会发生急性中毒，甲状腺功能亢进，心律失调等症状［3］。
20世纪80年代末期开始，在世界各地发生了多起克伦特罗中毒事件，我国在近几年也时有发生。
噬菌体抗体库技术的流程一、抗体库的构建。
咱先得有个来源去获取抗体基因呀。
这个来源可以多种多样呢，比如说从免疫过的动物或者人的淋巴细胞里获取。
就像是从一个装满宝藏的盒子里找东西一样，要把那些能产生抗体的基因找出来。
然后呢，把这些基因通过一些生物技术手段，像PCR （聚合酶链式反应）这种超级神奇的技术，把它们大量地复制扩增出来。
这就好比是给小种子浇水施肥，让它们变成一大片花海一样。
接着呢，要把这些基因和噬菌体的基因连接起来。
噬菌体就像是一艘小小的飞船，带着抗体基因这个特殊的“乘客”，准备开启一段奇妙的旅程。
二、噬菌体的展示。
构建好的噬菌体抗体库，这时候噬菌体就开始展示自己的“本事”啦。
噬菌体表面有一种特殊的蛋白，就像它的小手臂一样，这个小手臂可以把和它连接的抗体蛋白展示在噬菌体的表面。
这就好像是噬菌体在说：“看呀，我带着这个厉害的抗体蛋白呢！”这个展示的过程很重要哦，就像在舞台上表演一样，要让大家都能看到。
而且这个展示是随机的，每个噬菌体展示的抗体蛋白可能都不太一样，就像每个小朋友画的画都有自己的特色一样。
三、筛选过程。
这可是噬菌体抗体库技术里超级关键的一步呢！我们要找到我们想要的那个噬菌体，就是展示着我们需要的抗体蛋白的噬菌体。
这就像是在一堆沙子里找金子一样困难。
一般会用一种叫抗原的东西来筛选。
抗原就像是一把特殊的钥匙，只有能和它匹配的抗体（也就是展示在噬菌体表面的抗体蛋白）才是我们要找的。
把噬菌体抗体库和抗原放在一起，那些能和抗原结合的噬菌体就会被留下来，其他的就被淘汰掉啦。
这个过程可能要重复好多次呢，就像筛沙子要一遍一遍地筛，才能找到最纯净的金子。
四、鉴定与富集。
筛选出来的噬菌体还不能就这么直接用啦。
我们还得确定一下它们是不是真的就是我们想要的。
这时候就要进行鉴定啦。
可以用各种生物学的方法，像是检测噬菌体的基因序列呀，看看是不是和我们预期的一样。
同时呢，还要把筛选出来的噬菌体进行富集，就是让它们的数量变得更多。
抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：汪治华, 张国成*, 许东亮, 孙新, 李小青, 李思袖, 张学红, 聂晓晶, 豆玉凤【摘要】目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库, 搭建人源性抗体制备的技术平台, 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效途径。
方法: 从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA, 并逆转录为cDNA。
用PCR扩增轻链和重链Fd段（即重链的可变区和第一恒定区）基因, 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x噬粒载体, 电转化XL1Blue大肠杆菌, 经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库。
对此抗体库双酶切进行鉴定, 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选。
结果: 经过重轻链基因的重组, 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库, 共有2.6×106个不同的克隆菌, 其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd 基因。
因此, 所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106, 经初步筛选, 抗体库得到了不同程度的富集。
结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术, 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库, 为进一步的研究奠定了基础。
【关键词】抗体库; 噬菌体展示技术; Fab抗体; 呼吸道合胞病毒; 儿童随着分子生物学的发展, 基因工程抗体技术的出现, 尤其是噬菌体抗体库技术, 为各种不同免疫原人源性抗体的制备提供了新途径, 成为抗体工程领域革命性的进展［1］。
我们以52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞作为基因来源, 成功地构建了一个人源性Fab段免疫噬菌体抗体库, 并对其进行了初步鉴定, 为研制诊断、治疗和预防小儿呼吸道病毒感染的基因工程药物奠定了基础, 同时也将解决鼠源性抗体在临床应用中存在的不足。
1 材料和方法1.1 材料选取52例经ELISA法检测呼吸道合胞病毒IgM和/或IgG 抗体阳性的患儿, 每例患儿抽取血液2 mL, 共约100 mL。
噬粒载体pComb3x（含氨苄青霉素抗性基因）, 大肠杆菌菌珠 XL1Blue（带四环素抗性基因）, 辅助噬菌体M13K07(具卡那霉素抗性基因)由第四军医大学李郁博士惠赠。
焦碳酸二乙酯购自AMRESCO公司, TRIzol 购自Invitrogen公司, RNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司, Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司, 限制性内切酶Spe I、Xho I、 Sac I、 Xba I购自Promega公司, 呼吸道合胞病毒Long 株（RSV Long）, 由本实验室保存。
1.2 方法1.2.1 淋巴细胞的分离和总RNA的提取用淋巴细胞分离液分离约100 mL外周血淋巴细胞, 用TRIzol法提取总RNA, 取适量进行甲醛变性胶电泳并用分光光度计测A值以鉴定RNA的质量。
1.2.2 轻链基因和重链Fd段基因的扩增 PCR引物设计及扩增参照文献［2］, 共23条引物, 由Generay Biotech 公司合成。
按RNA 逆转录试剂盒中的说明, 将总RNA逆转录为cDNA, 以其为模板, PCR 扩增轻链及重链Fd段基因, 扩增条件为: 94℃ 50 s, 55℃ 50 s, 72℃ 1 min, 共30个循环; 并分别引入酶切位点Sac I+Xba I和Spe I+Xho I。
将全部抗体基因产物经琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.3 轻链基因库和Fab段抗体基因库的构建及鉴定轻链基因的扩增产物经Sac I和Xba I双酶切后回收, 与经同样酶切回收的pComb3x载体片段相连接, 并电转化E.coli XL1Blue感受态菌, 构建轻链基因库。
取适量菌液稀释后, 接种于SOBAG琼脂平板（含氨苄青霉素100 mg/L, 葡萄糖20 g/L）, 以测定转化率, 并随机挑选10个单克隆菌, 酶切鉴定轻链库的重组率。
其余菌液扩大培养后提取质粒, 经Spe I和Xho I双酶切, 回收带有多样性轻链基因的载体大片段; Fd段重链基因也以Spe I和Xho I双酶切后回收, 用T4 DNA连接酶将回收的两种基因片段连接, 将连接产物电转化 E.coli XL1Blue, 其余构建Fab段抗体基因库步骤同轻链基因库的构建。
1.2.4 Fab段噬菌体抗体库的构建及初步筛选将Fab段抗体基因库的菌液转入SB A+T+液体培养基（含100 mg/L氨苄青霉素和10 mg/L四环素）中37℃振荡培养2 h, 然后按1×1012pfu/100 mL加入辅助噬菌体M13K07和卡那霉素（终浓度70 mg/L）, 于37℃培养过夜。
次日, 将扩大培养的菌液于4℃以4 000 r/min离心15 min, 加入40 g/L PEG8000沉淀, 用含有10 g/L BSA和100 g/L甘油的PBS重悬沉淀, 瞬时离心, 取上清即为噬菌体抗体库。
用纯度为1×1015/L 的Long株RSV颗粒作抗原进行初步筛选, 将RSV包被于96孔板于4℃过夜, 次日, PBS洗涤后, 用30 g/L BSA PBS封闭, 于37℃孵育1 h。
将上述噬菌体抗体库溶液加入96孔板于室温孵育1 h后倒空, 用含0.5 mL/L Tween的PBS洗涤10次后, 再用PBS洗涤10次。
加入对数期生长的E.coli XL1Blue和M13K07, 于37℃孵育2 h以让其再感染和进行噬菌体挽救, 并测定抗体库的滴度, 其测定方法为: 将抗体库按比例稀释后取1 μL与100 μL对数期生长的XL1blue 菌液混合, 37℃缓慢振荡反应20 min, 加入Top Agar 3 mL, 铺至37℃预热不含抗生素的LB琼脂平皿, 37℃培养过夜, 计算平皿上噬斑形成单位（pfu）。
重复上述淘筛过程3遍。
每轮筛选完毕后均按如下过程对抗体库进行ELISA检测: 将100 μL RSV包被于96孔板4℃过夜; PBS洗涤后于每孔加入10 μL待测噬菌体抗体, 并用含20 g/L 脱脂奶的PBS于室温封闭2 h; 加入HRP抗M13抗体孵育1 h; 用PBST洗涤5次, 加入ABTS置室温30 min后测A值。
2 结果2.1 淋巴细胞的分离和总RNA的提取提取的总RNA凝胶电泳显示条带完整, A260/A280值为2.03, 说明提取的总RNA质量较好(图1)。
图1 总RNA凝胶电泳分析2.2 轻链基因和重链Fd段基因的扩增取适量轻链基因和重链Fd段基因的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 在约700 bp处均可见扩增条带, 与预期的大小相符（图2）。
2.3 轻链基因库和Fab段基因库的构建及鉴定从轻链基因库14 mL 转化产物中取1 μL稀释后铺于琼脂平板上, 共长出205个单克隆菌落, 从而推算转化子数为205×14×103=2.9×106; 随机挑取的10个菌落的质粒经Sac I和Xba I双酶切后电泳, 其中有8个可得到700 bp左右DNA片段, 为轻链基因插入片段, 重组率为80％, 则其库容量为2.9×106×0.8=2.3×106。
用同样的方法, 得到Fab抗体基因库转化子数为2.6×106, 随机挑取的13个克隆中有9个酶切出Fd段DNA片段, 则重组率为9/13(约70％)（图3）, 则其库容量为2.6×106×0.7=1.8×106。
2.4 Fab段噬菌体抗体库的构建及初步筛选以RSV作为抗原对噬菌体抗体库进行了3轮“吸附洗脱扩增”的筛选, 测定抗体库滴度分别为 1.2×105、 1.8×106、 9.4×106 pfu, 显示了明显增加的趋势, 第3轮比第1轮增加了78倍, 说明特异性噬菌体得到了富集; 每轮均经ELISA检测, A值分别为0.23、 0.56、 1.05, 随着筛选轮数的增加而逐渐增加。
3 讨论呼吸道合胞病毒感染在儿科很常见, 每年均有暴发, 发病率高, 90%在2岁前均感染过RSV［3］, 但目前尚无理想的抗病毒药物。
1891年, Emil von Behring首次将来自动物的白喉抗毒素血清用于白喉感染患儿的治疗取得较为满意的疗效, 从而为抗体用于感染性疾病的治疗奠定了基础［4］。
杂交瘤技术的创立, 为mAb用于感染性疾病的治疗提供了可能, 但是鼠源性的mAb因HAMA反应等副作用而受限于临床应用［5］。
噬菌体抗体库技术的出现, 首次为获得完全人源性的mAb提供了一条佳径。
噬菌体展示技术是一种分子多样性技术, 它让大量不同的多肽或蛋白展示在丝状噬菌体的表面［6］。
针对几乎任何抗原的高亲和力特异性抗体均可在噬菌体抗体库中筛选出, 使mAb 用于肿瘤、感染性疾病等的诊断、治疗成为可能［7, 8］。
与费时而繁杂的mAb技术相比, 噬菌体抗体有稳定的基因来源, 可以通过DNA重组, 迅速而经济地制备各种人源性抗体而无动物免疫原性, 从而适合体内诊断与治疗［9］。
有两种途径可以获得高亲和力的抗体, 一种是构建大容量的天然抗体库, 另外就是构建免疫抗体库［10］。
从免疫抗体库中获得的抗体其亲和力较从天然抗体库中获得的要高, 而且无交叉免疫源性。
我们选用呼吸道合胞病毒感染患儿的淋巴细胞作为基因来源, 将减少抗体的多样性, 但可以从相对较小库容的抗体库中获得高亲和力特异性抗体。
通过初步鉴定, 我们所构建的抗体基因库库容量为1.8×106, 经过3轮淘筛, 特异性Fab抗体得到较好的富集。
因此, 我们成功构建了一免疫噬菌体抗体库, 为后续的实验和进一步研究打下了良好的基础, 也将有益于小儿呼吸道合胞病毒感染的诊断、治疗和预防。
【参考文献】［1］ Hoogenboom HR, de Bruine AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its applications［J］. Immuno Technol, 1998, 4(1): 1-20.［2］李晓琳, 侯宗柳, 刘建生, 等. 超大容量非免疫人源性Fab抗体库的构建［J］. 云南医药, 2006, 27(2): 94-97.［3］ Ogra PL. Respiratory syncytial virus: the virus, the disease and the immune response［J］. Paeditr Respir Rev, 2004, 5(2): 119-126.［4］何维. 医学免疫学［M］. 北京: 人民卫生出版社, 2006: 24-48.［5］ Hughes D. Therapeutic antibodies make a comeback ［J］. Drug Discovery Today, 1998, 3(10): 439．［6］ Clackson T, Lowman HB. Phage display A practical approach［M］. Oxford University Press Uk, 2004: 15-28.［7］ Binyamina L, Borghaei H, Weiner LM. Cancer therapy with engineered monoclonal antibodies［J］. Update CancerTherapeutics, 2006, 1(2): 147-157.［8］ Kang XP, Yang BA, Hu YY, et al. Human neutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage display［J］. Clin Vac Immunol, 2006, 13(8): 953-957.［9］ Azzazy HM, Highsmith WE. Phage display technology: clinical applications and recent innovations［J］. Clin Biochem, 2002, 35(6): 425-445.［10］ Bowley DR, Labrijn AF, Zwick MB, et al. Antigen selection from an HIV 1 immune antibody library displayed on yeast yields many novel antibodies compared to selection from the same library displayed on phage［J］. PEDS, 2007, 20(2): 81-90.。
