T载体研究进展_林陈水

L IN Chen- shui, WU Sheng- w ei, YANG Dan- y an
( C ol lege of Ph amaceut ical Science, Zhejiang U n iversit y of T ech nology, H angzhou 310032, C hina)
T 载体按照功能可分 为克隆型 T 载体 与表达 型 T 载体, 目前市场上供应的 T 载体主要是克隆型 T 载体, 具有克隆目的基因的功能, 仅满足基因保存 和测序的需要. 若要表达目的基因, 还需要将目的基 因重组至表达载体中. 而表达型 T 载体具有克隆目 的基因和表达目的基因的功能, 还具有其他独特优 势, 但其构建还存在一些难点. 只有 P romeg a 公司 的 pT A RG ET TM V ecto r 和 Q IA G EN 公司的 pG WT Vect or 以及上海生工生物工程技术服务 有限公 司的 pU Cm- T Vect or 等极少数的用于表达, 且表达 的蛋白会由于起始密码子 AT G 与目的基因片段间 有一定数目碱基存在, 表达后在其 N 端比天然蛋白 产物多出几个氨基酸. 笔者综述了 T 载体的构建方 法及其应用、表达型 T 载体的优势及其构建难点.
与胡晓梅等[ 7] 的/ 两步法0相比, Chulman 等[ 9] 开发出了更简便的/ 一步法0. 他们设计了一条包含 BamH Ñ , N co Ñ和 X cm Ñ 酶切位点的引物, 以小鼠 肝细胞染色体为模板, 扩增 出一段长 550 bp 的 序 列, 将该序列及出发 载体分别用 B amH Ñ 消化, 纯 化后连接, 得到的载体再经 X cm Ñ 酶切后即得到线
第6期
林陈水, 等: T 载体研究进展
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图 1 用于构建 T 载体的寡核苷酸酶切盒的分子 设计
F ig. 1 M olecule design of oligo nucleo tide r est riction endonuclease cassettes used t o prepare T v ecto r
1 T 载体的构建方法
1. 1 平末端加 T 法 将载体通 过平 端内 切酶 线性 化切 平 末端, 用
T aq DNA 聚合酶催化, 在 3c末端加上 dT , 回收后即 得到 T 载体[ 5] . 岳昌明等[ 6] 提取生物公司商业化 T 载体克隆转化蓝白斑菌落中蓝色菌落收集, 扩大培 养后提取质粒 DNA, 用限制性内切酶 E coRV 酶切 环化质粒为平末端线性 DNA, 用 T aq DNA 聚合酶 催化, 构建了 T 载体, 对小麦差异显示片段进行了 克隆, 经过验证该 T 载体克隆效率在 90% 以上. 虽 然该方法简便易行, 但平末端加 dT 的效率远远达 不到 100% , 由于 3c末端加 dT 为非优先聚合核苷酸 及 T aq 酶的工作效率随反应体系中越来越多的 T 末端产生而降低, 这就导致少量两端均未加 T 的平 端线性化质粒的存在, 在与 P CR 产物连接过程中难 以避免载体自身环化. 每次生产 T 载体产量有限 ( 一般为 1 Lg) , 不适于大规模生产, 且 dT 碱基不太 稳定, 故批次质量不稳定. 1. 2 脱氧核苷酸末端转移酶( TDT) 法
摘要: T 载体是直接克隆或表达 P CR 产物的新型载体, 重组过程无需酶切和纯化, 简便高效. 在总
结国内外研究的基础上, 概述了构建 T 载体的方法, 其中内切酶法是 T 载体制备方法中最先进的
方式. 阐述了 T 载体在抗体库构建、目的基因克隆、某些蛋白的融合表达方面的应用以及目前 T 载
体的商业化. 对表达型 T 载体与克隆型 T 载体进行了比较, 其中表达型 T 载体可以同时满足基因
Abstract: T- vect or s ar e a t ype of novel vect or s t o direct ly clone or ex press PCR f rag ments. T he method need no t dig estion and purificat ion of P CR f ragments, w hich is easier and mor e ef ficient. Based on the national and int er nat io nal researches, t his paper review s t he kinds o f methods t o const ruct T- vect or s, in w hich t he rest riction enzy me met ho d is t he m ost adv anced. T he application of T- vectors in const ruction of ant ibody library, cloning of gene, fusion ex pression of some prot eins and its commercializat ion are int roduced. And cloning and expression T- vectors are compared. T he results show that expression- T- vect ors can be used as both cloning and expression of gene, also having possession of ot her peculiar advant ages. Finally, difficulties in constructing expression- T- vectors are int roduced, and the development trends of T- vect ors are prospected.
对 Mss Ñห้องสมุดไป่ตู้切盒用 B amH Ñ 和 H i nd Ó进行酶 pRSET- A 中. 将构建载体用 MssÑ酶和 EcoR Õ酶双酶
T 载体是一种用于直接克隆 PCR 产物的新型 载体, 其分子末端各有一个 3cdT ( 脱氧胸苷) 突出, 恰好可与 P CR 产物末端由于 T aq DNA 聚合酶非 模板依赖的末端转移酶活性而添加 的 dA ( 脱氧 腺 苷) 互补配对, 这样可将 PCR 产物以粘性末端连接 的方式直接克隆到载体上. 利用 T 载体进 行 PCR 产物克隆的方法称为 T A 克隆. T A 克隆是 一种快 速的, 一步到位的克隆法, 可以把 P CR 产物直接插 入到质粒载体中. 这种方式不仅克服了常规方法的 缺点, 而且操作简便、方法快捷及连接效率高, 应用 日益广泛.
克隆和表达的需要, 还具有其他独特的优势. 介绍了表达型 T 载体的构建难点, 探讨了今后 T 载体
的研究发展方向.
关键词: T 载体; 克隆; 表达
中图分类号: Q782
文献标识码: A
文章编号: 1006- 4303( 2009) 06- 0623- 06
Development of T-vectors
收稿日期: 2008- 10-13 基金项目: 浙江省自然科学基金资助项目( Y206760) 作者简介: 林陈水( 1969 ) ) , 男, 浙江遂昌人, 高级工程师, 主要从事蛋白质工程研究.
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浙江工业 大学学报
第 37 卷
的载体上, 这种方法克隆效率非常高. 但如果酶切位 点相距太近, 则可能导致酶切效率不高或酶切失败. 如果保护碱基太多, 可能会影响 PCR 扩增反应, 同 时也会增加不必要的费用. 而这种酶切失败当时又 无法鉴定, 只有等到连接、转化、酶切甚至测序后才 发现, 浪费了大量的宝贵时间和研究费用[ 3] . 非定向 克隆有平末端克隆法, 在 Klenow 酶和 T 4 DNA 聚 合酶作用下修平 PCR 产物末端与经平端内切酶消 化的载体连接, 但连接 效率低, 仅为粘末端连接 的 1/ 50, 自身环化率高且容易形成串联插入[ 4] . 具体而 成熟的克隆方法有平端连接法、粘末端克隆法、无连 接酶亚克隆法和共环消解法等. 各种策略都建立了 相应载体, 不过这些现有的克隆载体虽然都能够达 到克隆的目的, 但是也各有一定的不足之处. 例如有 的载体容易自连, 有的筛选阳性克隆困难, 有的实验 费用 较 高、过 程复 杂, 而 且一 般 情况 下 克隆 效 率 不高.
Key words: T- vect or s; clo ning; expressio n
0引言
PCR 是目 前体外 基因 扩增最 常用 的方 法, 对 PCR 产物进行快杂
P CR 产物中分 离目的片 段等下 游实验, 实现 P CR 产物多种用途的必经之路[ 1] . 为此, 国内外许多学者 探索了很多不同的克隆方法. 常用的方法有非定向 克隆和定向克隆[ 2] . 定向克隆需在引物 5c末端引入 限制性内切酶位点, P CR 产物经适当限制性内切酶 酶切后产生粘端, 连接到经相应限制性内切酶酶切
胡晓梅等[ 7] 用化 学合成的方 法得到两 条带有
Bg l Ò位点和 X cm Ñ 酶切位点的寡聚核苷酸, 退火 复性后得到酶切盒, 其结构如图 1 所示, 再与用平端 内切酶 E coR V 消 化 后的 出 发载 体 连 接; 将 间 隔 DNA 插入到 B gl Ò位点中; 最后再用 X cm Ñ 消化 所得到 的 质 粒 载 体从 而 获 得 线 性 化 的 T 载 体. T est to ri[ 8] 等所用的方法与此类似.
在线性化载体的 3c末端加上双脱 氧胸腺嘧啶 核苷酸( ddT T P ) . 这种方法[ 5] 存在明显缺点: 一是 同样不能保证 100% 的载体分子末端都能加上 dT , 二是难以控制加上去的正好是 1 个 dT . 1. 3 内切酶法
利用限制性内切酶制备 T 载体是 T 载体制备 方法中最为先进的方式, 国内外的一些学者都进行 了尝试, 并建立了相应的 T 载体. 在内切酶家族中, 有一类称可变酶, 它们的识别序列中的一个或几个 核苷酸是可变的, 而这些可变的核苷酸并不影响该 酶的特异性和酶切效率, 这就为酶切盒的设计提供 了极大的方便和可能. 可用于生产 T 载体的限制性 内切酶主 要有: A hd Ñ , H p h Ñ, A sp E Ñ, Mbo Ò, M n1 Ò和 X cm Ñ .