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6-DNA重组

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分子生物学 6 DNA 损伤、修复和重组

分子生物学 6 DNA 损伤、修复和重组

吖啶橙、原黄素、吖黄素等吖啶类染料 嵌合到DNA碱基对之间 base addition /deletion / frameshift mutation
DNA损伤（DNA damage）
自发损伤: 脱氨基/ 脱嘌呤 外源损伤: 1. 氧化损伤 (需氧细胞) 活性氧：超氧化物，过氧化氢和羟自由基（· OH） 8-氧鸟嘌呤，2-氧腺嘌呤，5-甲酰尿嘧啶 2. 烷基化损伤 影响DNA复制和转录时的解旋 多数是间接诱变 3. 加成损伤 嘧啶二聚体 苯并芘（肝脏细胞色素P-450） 双环氧物-G 芳基化试剂 黄曲霉毒素B1（肝致癌剂）
DNA损伤、修复和重组
突变和突变发生
（mutation and mutagenesis) DNA损伤（DNA damage） DNA修复（DNA repair） 重组（recombination）
突变概念
突变（mutation） DNA分子碱基序列的可遗传改变 突变体（mutant） 与野生型（+）相对 突变剂（mutagen） 突变发生（mutagenesis） 自发突变（spontaneous mutation） 诱发突变（induced mutation）
突变类型 1. DNA碱基序列改变的多少 单点突变（point mutation） 碱基替换（base substitution） 转换（transition） A-T G-C 颠换（transversion）A-T T-A 碱基增加（base addition） 碱基删除（base deletion） 多点突变（multiple mutation）
BER
5' 3' UvrABC 3' 5' 3' 5' Pol I (或δ和ε） 5' 3' DNA glycosylase 5' 3' AP内切核酸酶 5' 3' 进一步酶切

第六章 重组DNA导入受体细胞

第六章 重组DNA导入受体细胞

根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染

重组DNA

重组DNA

目的基因 自连
1）一定数量的载体自身环化分子，产生较高的
假阳性在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体
的5’磷酸以抑制质粒DNA的自身环化。
2）用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA， 连接时插入片段可以两个方向插入载体中。
3）片段的多拷贝插入
适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝 插入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：
（一）DNA重组的方法 1、分类： 粘端连接法 平端连接法 依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体 与外源DNA上限制酶酶切位点的性质来做选择。
1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
• 除了重组体以外，还有质粒分子的自身 环化，重新形成完整质粒，这是基因重
组中产生了假阳性。
如何提高连接的效率，防止假阳性的产生？
• 1 连接前使用碱性磷酸酶，去除载体5`端的
磷酸抑制质粒的重新环化。
• 2 调节外源DNA 和克隆载体的比例
• 3 定向克隆，使用两个限制性内切酶
不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA

DNA重组技术

DNA重组技术

8
10
② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
12
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
23
PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
29
30
6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。

DNA的重组

DNA的重组

有些细菌在自然条件下不发生转化或转化 效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。 例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细 胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。
转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。 转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。如：感受态因、 10多个基因编码的功能 感受态因、 与膜结合的DNA结合蛋白、自溶素、多种核酸酶等 DNA结合蛋白 与膜结合的DNA结合蛋白、自溶素、多种核酸酶等。感受态因子诱导与 感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白、 DNA结合蛋白 感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白、核酸酶 裸露，当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后， DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后 裸露，当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后，核酸酶使其中一条 链降解，另一条链被吸收，与染色体DNA重组。 DNA重组 链降解，另一条链被吸收，与染色体DNA重组。
3.细菌的转导 转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因 从供体转移到受体细胞的过程。 转导有两种类型 普遍性转导(generalized transduction):是指宿 主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗 DNA 粒DNA的一部分而被带入受体菌。 局限性转导(specialized transduction)：某些温 和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合 部位的DNA切割下来取代病毒DNA。
小鼠： J λ C λ3 小鼠：Vλ2 人： Vλ～ 300 J λ C λ6 λ 小鼠重链基因族（ 号染色体 号染色体） 小鼠重链基因族（12号染色体）
细菌的结合作用
traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞 基因编码表面排斥蛋白，阻止F 细胞之间的转移， 细胞的性菌毛与F

第二十三章 DNA重组和重组DNA技术【生物化学与分子生物学 9版原版】

第二十三章 DNA重组和重组DNA技术【生物化学与分子生物学 9版原版】

第二节
重组DNA技术
序言：
重组DNA技术
又称： 分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因工程（genetic engineering）
主要过程：
——在体外将目的DNA与能自主复制的遗传元件（载体）连接， 形成重组DNA分子 ——重组DNA分子在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得 单一DNA分子的大量拷贝
• 大多数RE的识别序列为回文结构（palindrome） • 有些RE所识别的序列虽然不完全相同，但切割DNA双链后可产
生相同的黏端，这样的酶彼此互称同尾酶（isocaudamer） • 有些RE虽然来源不同，但能识别同一序列（切割位点可相同或
不同），这样的两种酶成同裂酶（isoschizomer）
克隆载体
——是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子。
克隆载体的基本特点：
至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到 同步扩增； 至少有一个选择标志（selection marker），从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如 抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等； 有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。
第一节小结
小结：
自然界DNA重组方式 主要包括： 同源重组，Holliday模式是最经典的同源重组模式 位点特异性重组 转座重组或转座，包括插入序列和转座子的重组 接合，通过细胞接触所发生的基因转移 转化，通过细胞自主摄取发生的DNA整合 转导，病毒感染介导的DNA整合 CRISPR/Cas9系统，细菌获得病毒DNA用于攻击病毒
一、同源重组
同源重组的Holliday模型

重组DNA-分子克隆技术

202X
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
单击此处添加正文具体内容
主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；

DNA重组的主要步骤

DNA重组的主要步骤
DNA重组是指通过分离、移植和修饰DNA序列来改变基因组的过程。

主要步骤如下:
1.DNA分离: 通过酶切、洗脱或电泳等方法将所需
的DNA片段从基因组中分离出来。

2.DNA连接: 使用酶如连接酶或DNA连接酶将所
需的DNA片段连接在一起。

3.DNA克隆: 将连接好的DNA片段插入到载体中，
如质粒或菌系，进行DNA克隆。

4.DNA纯化: 从质粒或菌系中纯化出重组DNA。

5.DNA检测: 通过测序、质粒分析或其他方法检测
重组DNA的纯度和完整性。

6.DNA应用: 将重组DNA应用于基因疗法、基因
工程、药物研发等领域。

重组技术是基因工程的基础，广泛应用于生物医药、农业等领域。

在这个过程中，需要使用高纯度DNA质粒和严格的操作条件来保证重组DNA的质量。

7.DNA转化：将重组DNA转化为目标细胞，使之
能够生长和繁殖。

8.筛选：筛选出含有目标基因的细胞。

9.验证：使用多种方法（如Southern南方杂交、PCR
聚合酶链反应等）来验证重组DNA的纯度和完整性。

10.应用：将重组DNA应用于基因疗法、基因工程、
药物研发等领域。

DNA重组技术是一种高精度的分子生物学技术，可以通过改变基因组结构来改变生物体的性状。

这项技术在基因疗法、基因工程、药物研发、农业等领域都有着重要应用。

在进行DNA重组时，需要严格遵循实验流程和操作规范，避免误操作。

分子生物学第7章 DNA的重组与转座


Barbara McClintock 芭芭拉·麦克林托克) (芭芭拉 麦克林托克) 19021902-1992
C基因-Ds基因-Ac基因： Ac-Ds 控制系统 基因-Ds基因-Ac基因： Ac基因 基因 《玉米易突变位点的由来与行为》(1950)，《染色体结构和基 玉米易突变位点的由来与行为》(1950)， 因表达》 因表达》(1951)
7.2.2 细菌的特异位点重组
鼠伤寒沙门氏菌H1鞭毛蛋白和 鞭毛蛋 鼠伤寒沙门氏菌 鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋 鞭毛蛋白和 白抗原表达的互变，称为鞭毛相转变， 白抗原表达的互变，称为鞭毛相转变， 这种转变是由H片段倒位决定的 片段倒位决定的， 这种转变是由 片段倒位决定的，此倒 位是由于特异重组位点hix发生重组后引 位是由于特异重组位点 发生重组后引 起的。 起的。
整合位点---attB、attP ◘ 整合位点 切除位点---attL、attR 切除位点 整合过程需要λ整合酶 ◘ 整合过程需要 整合酶 （integrase Int）（ 编码） ）（λ编码） ）（ 编码 和寄主的整合宿主因子IHF 和寄主的整合宿主因子 （integration host factor） ） 共同作用 ◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） （ ） attR（POB’） （ ）
Ⅰ型：两末端有相同的IS序列，或正向，或反向。 两末端有相同的IS序列，或正向，或反向。 IS序列 Ⅱ型：末端有反向重复序列。如TnA家族 末端有反向重复序列。 TnA家族
Tn A家族: A家族: 家族
TnA是复制型转座的转座子，长约5kb左右 TnA是复制型转座的转座子，长约5kb左右 。 是复制型转座的转座子 5kb 两端具有末端反向重复序列（而不是IS），长约38bp左右 IS），长约38bp左右， 两端具有末端反向重复序列（而不是IS），长约38bp左右， 任一个缺失都会阻止转座。 任一个缺失都会阻止转座。 中部的编码区编码三个基因：转座酶，解离酶和抗性基因， 中部的编码区编码三个基因：转座酶，解离酶和抗性基因， TnA家族都带有抗性标记 TnA家族都带有抗性标记 。 靶位点具有5bp的正向重复序列。 5bp的正向重复序列 靶位点具有5bp的正向重复序列。 解离位点（ TnA家族特有的内部位点 家族特有的内部位点。 解离位点（res）是TnA家族特有的内部位点。

DNA的重组

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大肠杆菌重组的分子基础
• 在分子水平上，重组事件发生的先后顺序是相似
• 同源性重组最主要特征是相关的酶可以利用任 何一对同源序列为底物。
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• 真核生物减数分裂时的染色体之间的交换， 某些低等真核生物及细菌的转化、转导、 接合，噬菌体的整合等都属于同源性重组 这一类型。 • 在整个基因组中，同源重组的频率并不恒 定，并且跟染色体的结构有关。例如在异 染色体附近遗传物质的交换要受到抑制。
单链的断裂，从而引发重组。
• 两个断裂单链的游离端彼此交换，形成两个异源
双链，然后末端连接形成Holliday连接体
（Holliday Junction）。
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• 一旦Holliday连接体形成后，它能进行重排从 而改变链的彼此关系。这种重排称为异构化， 因为在此过程中没有键的割裂。 • 一旦形成Holliday连接体后，就能被拆分。是
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4
5
5
6
DNA重组能迅速增加群体的遗传多样 性，通过优化组合积累有利突变，推动生 物进化。此外，DNA重组还参与DNA损伤
修复，某些基因表达的调控等重要的生物
学过程。
6
根据不同的机制，可将重组分成4类：
• 同源性重组（homologous recombination）
• 位点特异性重组（site-specific recombination） • 异常重组（illegitimate recombination) • 转座重组（transposition recombination）
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• D环在DNA聚合酶的作用下修补而扩展，直至D
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• DNA重组（recombination）是指发生在DNA分 子内或DNA分子之间核苷酸序列的交换、重排 和转移现象，是已有遗传物质的重新组合过程。
• 它主要有同源重组、位点特异性重组和转座重 组三种形式。
• 作用：
• 生物体通过重组，既可以产生新的基因或等位 基因的组合，还可能创造出新的基因，使种群 内遗传物质的多样性提高；此外，重组还被用 于DNA损伤的修复，而某些病毒利用重组将自 身的DNA整合到宿主细胞的DNA上。
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四、真核生物的同源重组
主要发生在细胞减数分裂前期I的两个配对 的同源染色体之间（非姊妹染色单体）， 先在细线期和合线期形成联会复合体，再 在粗线期进行交换。
也会发生在DNA损伤修复之中，主要用以 修复DNA双链断裂、单链断裂和链间交联 等损伤。
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如果不发生交换，则减数分裂受阻，以确保在交换发生之前
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（二）RecBCD蛋白
又称为RecBCD酶，由RecB、RecC和RecD三 个亚基组成，具有5种酶的活性，即外切核 酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单 链DNA外切酶。
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图6-5 RecBCD酶的在同源重组中的作用
产生单链DNA，为RecA发挥作用创造条
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（三）RuvA、RuvB和RuvC蛋白
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RuvA、RuvB和RuvC在同源重组中的作用
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图6-6 RuvC的作用模型
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4. 其它同源重组蛋白
在E. coli中大概有30种蛋白质与同源重组有关，
除了上面详细介绍的几种以外，还有：
参与E. coli所有的同源重组途径。
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RecA的主要功能包括： （1）促进2个DNA分子之间的链交换； （2）参与SOS反应—作为共蛋白酶（co-
protease）促进LexA 蛋白的自水解。
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图6-4 RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换
多成分是SOS-诱导的，这意味着它们在细 胞中正常的功能可能是重组介导的DNA修 复。
用于基因工程的某些菌株其参与重组的基 因几乎都无活性，这有利于防止大的质粒 之间和质粒与染色体之间发生不必要的重 组。
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三、E. coli几种重要的同源重组途径
（一）RecBCD途径
这是E. coli最主要的重组途径。除了
件，20由20此/1/3最1 终起动了链交换和重组反应
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χ序列是一段特殊的碱基序列，其一致序列 是5′- GCTGGTGG-3′，它的存在能显著 提高重组的频率。在重组中的作用是调节 RecBCD的酶活性，刺激RecBCD重组途径。
据估计，E. coli整个基因组含有 1000个以上
的χ 序列。
细202胞0/1/不31 能分裂。
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图6-9 位点上的重组。
参与重组的特异性位点需要专门的蛋 白质识别和结合。
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由文特尔召集、诺贝尔医学奖得主汉米尔 顿.史密斯领导的二十人精英小组首次制出 了合成染色体，染色体含有三百八十一个 基因、五十八万个base pair的基因密码。
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新生命体拥有人工DNA
•
这组染色体的DNA序列基本上参照一种
名为生殖支原体(Mycoplasma Genitalium)的细菌。
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制造设计基因组的技术未来可能会带来非 常可观的裨益：
用来制造人们目前意想不到的替代 能源， 像纯粹用蔗糖分解的丁烷和丙烷；
或者创造出能吸收二氧化碳的细菌，以纾 缓全球暖化。
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同源重组（homologous recombination）也称 为一般性重组（general recombination），它 是一种在两个DNA分子的同源序列之间直 接进行交换的重组形式。
同源重组不依赖于序列，但依赖于序列同 源性。
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同源重组的发生必须满足以下几个条件： （1）在进行重组的交叉区域含有完全相同 或几乎相同的核苷酸序列；
（2）两个双链DNA分子之间发生互补配对； （3）需要特定的重组酶的催化；
（4）形成异源的双链；
（5）发生联会（synapsis）。
RecE，RecJ，RecQ，RecF，RecR，RecT，RecG， Rus，RecN，SbcA，SbcB，SbcC，SbcD，DNA 拓扑异构酶I；DNA旋转酶；连接酶；聚合酶I； DNA解链酶II；DNA解链酶IV；SSB。
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E. coli主要有三条同源重组途径，其中的许
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一 、 同 源 重 组 的 分 子 机 制
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图6-1 同源重组的Holliday模型
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图6-2 电镜下的Holliday连接
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图6-3 同源重组的双链断裂模型
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以E. coli为例：
（一）RecA蛋白 RecA蛋白是同源重组中最重要的蛋白质，
• 研究员把它的DNA序列简化了五分之一，只 剩下足以维持生命的基本部分。
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研究小组已把这组染色体植入一个活菌细 胞中，成为一个近乎全新的生命体。
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•
这个新生命体的细胞自我复制和新陈代谢 的能力，和接受移植的细胞相关。
•
文特尔强调：“我们将从读取基因序列
阶段跃升到有能力编写，这将赋予我们做 一些从前从未想过的事情的能力。”
RecBCD蛋白以外，还需要RecA、SSB、 RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、 连接酶和旋转酶。此外，还需要χ序列.
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图6-8 RecBCD同源重组途径
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（二）RecF途径和RecE途径
RecF途径主要是质粒之间进行重组的 途径。
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