实验五 DNS法分析蛋白质N-末端

蛋白质N末端氨基酸测定——DNS-Cl法操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：16℃实验目的：1.了解蛋白质N末端氨基酸的测定方法。

2.了解DNS-Cl法测定N末端氨基酸的原理。

3.学会使用层析法测定物质组成。

实验原理：（1）DNS-Cl为一种荧光化学剂，pH10左右，DNS-Cl可以与蛋白质N末端α-氨基酸发生反应，生成DNS-蛋白质。

DNS-Cl与末端氨基酸形成的化学键非常稳定，经6M的HCl水解后，蛋白质的肽键被破坏，DNS-N末端氨基酸被水解游离。

（2）在酸性条件下，利用乙酸乙酯可萃取提纯水解游离的DNS-N末端氨基酸，且因DNS-N末端氨基酸在紫外灯照射下，可发出荧光，故便用于后续检测。

（3）层析法基本原理是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。

所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。

当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。

分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。

试验方法与过程：1.制备DNS-标准氨基酸：分别吸取0.3ml标准氨基酸（缬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸）于各小试管中，加入0.2mlDNS-Cl丙酮溶液，摇匀，封口，于40℃水浴锅中保温20min；取出后用吹风机加热，除去丙酮，剩余溶液用0.1MHCl酸化至PH值为2-2.5；加入乙酸乙酯300μL。

摇匀。

待分层。

2.聚酰胺薄膜层析：取聚酰胺薄膜一张，在距边线1cm处用铅笔做四个记号，分别用毛细管取分层后的乙酸乙酯层点于薄膜上，将下端浸入展层剂（甲酸：水=1.5：100），待展层剂到达距薄膜上部1cm 左右终止层析，取出吹干，在紫外灯下观察荧光点，拍照。

3.计算Rf 值：把在紫外灯下观察到的荧光点标于薄膜上，测量距离。

百泰派克生物科技
蛋白质N末端测序
蛋白质N末端即氨基（-NH2）端，是蛋白质合成的起始端。

蛋白质N末端测序就是对N-末端的氨基酸种类和排列顺序进行准确分析。

随着生命科学研究和测序技术
的发展，蛋白质末端序列分析的方法也在不断更新、进步。

目前，测定蛋白质或多肽N末端的方法主要有Sanger法、酶降解法、Edman法、二硝基氟苯法（FDNB法）、丹磺酰氯法（DNS法）和基于质谱的方法，其中Edman法和质谱法在N末端序列分
析中应用最广。

百泰派克生物科技提供基于质谱法和Edman法的蛋白质N末端测序一站式科研技术服务，用于蛋白或活性多肽N端序列分析，还可用于确认重组蛋白表达情况，如是否完整表达、表达过程是否发生断裂以及N端序列是否发生修饰等。

百泰派克生物科技还可根据需求提供定制化技术服务，欢迎免费咨询。

《生物化学》实验指导(8个实验)生物化学实验指导吕杰编著新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室内容介绍《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。

该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。

目目录实验一氨基酸纸层析4实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸5实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度7实验四酪蛋白的制备8实验五葡萄糖标准曲线的绘制10实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定12实验七酵母RNA的分离及组分鉴定14实验八维生素C的定量测定16 实验一一氨基酸纸层析一、实验目的1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。

二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。

由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。

缺点是展开时间较长。

分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。

在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。

三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：标准氨基酸溶液2、仪器:层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。

3、、试剂：（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。

（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0.1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮15克，丙酮100毫升四、实验步骤：纸层析(1)取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个+作为点样位置，共5个点。

N端测序：蛋白质氨基酸序列的开端分析
N端测序，特指蛋白质的N-末端测序，是用于确定蛋白质氨基酸序列开始部分的方法。

下面是关于N端测序的详细解释：
图1。

一、原理：
N端测序的经典方法是利用Edman降解。

在此过程中，蛋白质的最N端的氨基酸逐一被选择性地移除并被识别。

二、过程：
1、首先，蛋白质的N-末端与特定的化学试剂反应，形成一个可分离的化合物。

2、该化合物可以从蛋白质的其余部分分离出来，并被识别，从而确定最N端的氨基酸。

3、重复此过程可连续确定蛋白质的多个N端氨基酸。

三、优势：
1、具有较高的准确性和灵敏性。

2、能够准确地识别蛋白质的前几个氨基酸。

四、限制：
1、由于每次只能测序一个氨基酸，所以速度相对较慢。

2、对于长链蛋白质，该方法可能不太实用。

3、随着序列长度的增加，测序效率和灵敏度可能会下降。

五、应用：
N端测序在生物医学研究、疾病诊断和药物开发中都有广泛的应用，如：
1、确定蛋白质的起始位置。

2、辨别蛋白质是否经历了修饰或加工。

3、蛋白质鉴定和纯化。

DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸
DNS：丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）
强荧光剂
灵敏度高
反应原理
聚酰胺薄膜层析法
•原理：各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力不同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。

•优点：灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等
点样层析
PH9.9 的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸
实验原理
•荧光试剂DNS—Cl能与所有氨基酸的氨基结合，生成荧光物质DNS—氨基酸。

DNS—Cl 也能与蛋白质或多肽的游离氨基结合，生成DNS—蛋白质或DNS—肽，经酸水解后释放出DNS—氨基酸。

•各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力个同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。

DNS—氨基酸在360nm 或280nm 波长的紫外光照射下，发出黄绿色荧光，很方便进行检测。

•蛋白质和多肽经酸水解后，肽键断裂，生成游离氨基酸，所有氨基酸都能与DNS—Cl 反应。

所以DNS—Cl 法可用于蛋白质或多肽氨基酸组成的微量分析。

•在pH 值过高的情况下，DNS—Cl 会发生水解生成副产物DNS—NH2，DNS—OH 和DNS—Cl在紫外灯下产生蓝色荧光，可以与DNS—Cl 的黄绿色荧光区分开来。

测定多肽链氨基末端的方法氨基末端是多肽链的重要结构，其性质和组成对于多肽的功能和活性至关重要。

因此，准确测定多肽链的氨基末端是研究多肽的一个重要方面。

下面将介绍几种常用的测定多肽链氨基末端的方法。

1.N-末端测定方法N-末端测定主要是确定多肽链中氨基末端氨基酸的序列和组成。

常用的N-末端测定方法包括Sanger法和 Edman降解法。

（1）Sanger法Sanger法是一种经典的用于测定多肽链N-末端的方法。

该方法基于dNTP与目标多肽链N-末端氨基酸的反应，通过放射性同位素标记的dNTP来标记N-末端氨基酸的序列，然后通过酸水解和分离纯化，最终通过放射计数测定N-末端氨基酸的序列和组成。

（2）Edman降解法Edman降解法是一种基于弱碱水解来测定多肽链N-末端的方法。

该方法通过将多肽链与酸性媒介反应，使N-末端氨基酸脱离多肽链并生成硫酰化产物。

然后将硫酰化产物与酸性试剂反应，生成可转化为色谱染料的产物。

通过高效液相色谱的分离和测定，可以确定N-末端氨基酸的序列和组成。

2.C-末端测定方法C-末端测定主要是确定多肽链中的C-末端氨基酸的序列和组成。

常用的C-末端测定方法包括酶法、质谱法和化学标记法。

（1）酶法酶法主要利用酶对C-末端氨基酸的特异性反应来判定其序列和组成。

例如，利用甲酰化酶对开端的甘氨酸进行甲酰化反应，然后用高效液相色谱分离和测定甲酰化产物。

通过与已知标准反应产物的比较，可以确定C-末端氨基酸的序列和组成。

（2）质谱法质谱法是一种高精度的测定多肽链C-末端的方法。

通过质谱仪测定多肽链中的C-末端氨基酸的相对分子质量，可以确定其序列和组成。

常用的质谱法包括飞行时间质谱法（TOF-MS）和串联质谱法（MS/MS）。

（3）化学标记法化学标记法主要是利用特定的化学试剂对C-末端氨基酸进行标记，然后通过色谱技术进行分离和测定。

常用的化学标记试剂有二糖亚胺醇、二硫代苯乙酮等。

通过与标准物质的比较，可以确定C-末端氨基酸的序列和组成。

蛋白质N端和C端测序方法解析
蛋白质的N端和C端测序是分析蛋白质序列中的氨基酸排列的方法，特别是序列的开始和结束位置。

这种测序可以提供关于蛋白质的起源、结构和功能的重要信息。

图1。

一、N端测序（Edman 降解）:
Edman降解是一种经典的蛋白质N端测序方法。

在这个过程中，蛋白质的N端氨基酸逐个被选择性地移除，并进行识别。

该过程可以连续进行，从而得到蛋白质的氨基酸序列的前几个残基。

优势：具有高度的准确性和灵敏性。

缺点：该过程相对较慢，且难以测序长链的蛋白质。

二、C端测序:
与N端测序不同，C端测序的方法不如N端的成熟和普遍。

蛋白质的C端通常可以通过酶切或化学切割来识别。

利用特定的酶，如羧肽酶，可以从蛋白质的C端逐步地移除氨基酸。

通过分析被移除的氨基酸，可以推导出C端的序列。

但是，这种方法通常受到蛋白质结构和酶切位置的限制，可能不适用于所有蛋白质。

随着质谱技术的进步，特别是串联质谱，对蛋白质的全序列分析变得更加容易和准确。

通过酶切蛋白质，然后使用质谱测序得到的片段，可以重构出蛋白质的整个氨基酸序列，从而得到N端和C端的信息。

北京邮电大学计算机网络课程设计实验报告课程设计题目：dns中继服务器实验报告班级：2009211315班小组人员：李根 09211541 曾若峰 09211544 宫志明 09211545一、系统概述1) 运行环境：windows xp2) 编译： microsoft visual c++ 6.0 3) 使用方法:a) 使用ipconfig/all，记下当前dns服务器，例如为10.3.9.3 b) 使用下页的配置界面，将dns设置为127.0.0.1(本地主机)c) 运行你的dnsrelay程序(在你的程序中把外部dns服务器设为前面记下的10.3.9.3)d) 正常使用ping，ftp，ie等，名字解析工作正常二、系统的功能设计设计一个dns服务器程序，读入“域名-ip地址”对照表，当客户端查询域名对应的ip地址时，用域名检索该对照表，三种检索结果：1) 检索结果为ip地址0.0.0.0，则向客户端返回“域名不存在”的报错消息（不良网站拦截功能）2) 检索结果为普通ip地址，则向客户返回这个地址（服务器功能）3) 表中未检到该域名，则向因特网dns服务器发出查询，并将结果返给客户端（中继功能）? 考虑多个计算机上的客户端会同时查询，需要进行消息id的转换三、模块划分dns服务器主模块包含三个子模块，分别如下：1) 命令行参数处理模块：该模块用来处理通过命令行提示符来启动这个dns服务器时所输入的命令行参数，管理员通过设置不同的参数可以使dns服务器显示不同程度的提示和调试信息。

所以这模块主要是依照输入的参数设置标志数据，以控制最后的各种信息的输出。

2) 本地解析模块：本模块是在本dns服务器本地保存的曾经解析过的或者需要屏蔽额域名和其对应ip信息文件中查找从应用程序来的请求解析的域名，在这个文件中查到需要的域名后取出对应的ip地址，并构造dns应答数据包返回给发送此dns域名解析请求的应用程序。

探索分泌蛋白组学：蛋白质N端序列分析法分泌蛋白是细胞通过胞外分泌途径释放到细胞外的蛋白质，扮演着调节细胞间通讯、信号传导和生理功能调控等重要角色。

了解分泌蛋白的结构、功能和代谢动力学对于理解细胞的生物过程和开发生物药物具有重要意义。

蛋白质N端序列分析法作为一种强大的技术，可以帮助我们揭示分泌蛋白的N端序列信息，为分析和研究分泌蛋白组学提供新的视角。

本文将详细介绍蛋白质N端序列分析法的原理、技术和应用，并探讨其在生物药物研究中的潜力和前景。

1.蛋白质N端序列分析法的原理和技术。

1.1 原理。

蛋白质N端序列分析法基于测定蛋白质的N端序列来揭示分泌蛋白的结构和功能。

通过测定蛋白质N端的氨基酸序列，可以确定蛋白质的起始位置和信号肽的剪切位置，从而推断其胞内合成和胞外分泌的过程。

1.2 技术。

蛋白质N端序列分析法主要依赖质谱技术进行分析。

首先，通过蛋白质的消化和纯化过程，将目标蛋白质的N端片段分离出来。

然后，利用质谱技术进行测序分析，确定N端氨基酸序列。

常用的质谱技术包括液相色谱质谱（LC-MS）和串联质谱（MS/MS），这些技术能够提供高分辨率和准确的蛋白质N端序列信息。

2.蛋白质N端序列分析法在分泌蛋白组学中的应用。

2.1 分泌蛋白的结构和功能研究。

蛋白质N端序列分析法可以帮助科学家们深入了解分泌蛋白的结构和功能。

通过分析分泌蛋白的N端序列，我们可以推断其胞内合成和胞外分泌的过程，了解信号肽的剪切和分泌机制，从而揭示蛋白质的功能特性。

2.2 蛋白质代谢动力学研究。

蛋白质N端序列分析法还可以用于研究分泌蛋白的代谢动力学。

通过测定分泌蛋白N端序列的变化，可以了解蛋白质的合成和降解速率，评估其稳定性和半衰期，为药物代谢和疗效评估提供重要参考。

2.3 生物药物研发中的应用。

蛋白质N端序列分析法在生物药物研发中具有重要应用价值。

通过分析生物药物的N端序列，可以确定其胞内合成过程，评估其质量和稳定性。

此外，蛋白质N端序列分析还可以用于生物药物的相似性比较和质量一致性评价，为生物药物的研发和上市提供支持。

蛋白质n端测序原理
蛋白质N端测序是一种常用的方法，用于确定蛋白质的氨基酸组成和序列。

该方法的原理基于蛋白质N端的氨基酸序列独特性。

首先，需要将要测序的蛋白质通过一系列的分离和纯化步骤获得较高纯度的蛋白质样品。

通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或高效液相色谱等技术来实现。

接下来，将蛋白质样品进行水解，常见的方法是利用酶或酸来将蛋白质水解为一系列短肽。

常用的酶包括胰蛋白酶和氨基酸脱肽酶。

然后，水解产物中的短肽将通过逐步分离和纯化的方法，以便将它们分离为尽可能单一的肽段。

之后，这些肽段将通过质谱仪进行质谱分析。

在质谱分析中，肽段将被离子化并通过质谱仪中的引导电场进行加速。

在质谱仪的分析部分，质谱仪会根据肽段的质量和电荷比进行测量，并生成质谱图。

通过解读质谱图，可以确定肽段的氨基酸组成和序列。

在质谱图中，每个肽段将对应一个峰，其质量由质谱仪测得。

通过对这些质量峰进行识别和碎片质谱分析，可以获得蛋白质N端的氨基酸序列。

总之，蛋白质N端测序的原理是通过分离、水解、质谱分析
和解读质谱图，来确定蛋白质N端的氨基酸组成和序列。

该方法在蛋白质研究中具有重要的应用价值。