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【电子显微镜,分类和电镜样品制备技术】电镜样品制备电子显微镜分类和电镜样品制备技术电子显微镜技术简称电镜技术，它包括电子显微镜(electronmicroscope)和样品制备技术(techniquesofsamplepreparation)两大方面。
电子显微镜的基本原理与光学显微镜相同，但光源和透镜有所不同，电镜利用电子束作光源，电磁场做透镜，因而最佳分辨率可达1-2，放大倍率达150万倍。
样品制备技术是制作电镜标本的综合技术，比光学显微镜制片过程更精细和复杂。
它包括普通样品制备技术(如超薄切片技术)和特殊样品制备技术(如电镜酶细胞化学技术)。
第一台电镜诞生于1931年，至今已有70余年的历史，经过不断的改进和提高已从最初的一种电镜发展为多种电镜，分辨率可达到1。
近年来，随着电镜计算机的一体化，使新型电镜的操作更为简便，图像获取更快捷，而且电镜图像在观察过程中可以得到即时储存和统计分析等，大大提高了电镜的使用效率。
电子显微镜技术是研究细胞超微结构最重要的手段。
广泛应用于医学生物学等各个学科，在现代医学科学研究和临床疾病的诊断中发挥着重要的作用。
(一)电子显微镜的种类电子显微镜是以电子束作光源、电磁场作透镜、具有高分辨率和放大倍率的显微镜。
电镜通过收集、整理和分析电子与样品相互作用产生的各种信息而获得物体的形貌和结构等。
电镜的类型也是利用电子信号的不同和成像的不同而进行分类。
主要分为透射电子显微电镜、扫描电子显微电镜、分析电子显微镜和高压电子显微镜。
1、透射电子显微电镜透射电子显微电镜(transmmisionelectronmicroscope)，是发展最早、应用最广泛的电镜，一般所说的电镜指的便是透射电镜。
透射电镜主要用于观察组织细胞的内部结构。
透射电镜由三大系统组成，包括镜体系统、真空系统和电子线路系统。
镜体系统是电镜的主体，结构相当复杂，又分为照明系统、成像系统和观察记录系统。
照明系统由电子枪和聚光镜组成，电子枪发射电子作为电镜的照明光源。
扫描电镜测试生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分,而且比较柔软,因此,在进行扫描电镜观察前,要对样品作相应的处理。
扫描电镜样品制备的主要要求是:尽可能使样品的表面结构保存好,没有变形和污染,样品干燥并且有良好导电性能。
一.样品的初步处理(一取材样品面积可为8mm×8mm,厚度可为5mm。
对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等,可固定在滤纸或卡片纸上,以充分暴露待观察的组织表面。
(二样品的清洗用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面,即组织的游离面。
由于样品取自活体组织,其表面常有血液、组织液或粘液附着,这会遮盖样品的表面结构,影响观察。
因此,在样品固定之前,要将这些附着物清洗干净。
清洗的方法有以下几种:1.用等渗的生理盐水或缓冲液清洗;2.用5%的苏打水清洗;3.用超声震荡或酶消化的方法进行处理。
例如清洗肠粘膜表面的粘液,可用下面的方法:清洗液配方:透明质酸酶300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理盐水 100 ml清洗液的pH为5.5~6。
清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中,边浸泡边震荡30分钟,最后用双蒸水洗3次。
无论用哪种清洗方法,注意在清洗时不要损伤样品。
(三固定固定样品的常用试剂为戊二醛及锇酸双固定。
由于样品体积较大,固定时间应适当延长。
也可用快速冷冻固定。
(四脱水样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水,然后进入中间液,一般用醋酸异戊酯作中间液。
二.样品的干燥扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。
无论是水或脱水溶液,在高真空中都会产生剧烈地汽化,不仅影响真空度、污染样品,还会破坏样品的微细结构。
因此,样品在用电镜观察之前必须进行干燥。
干燥的方法有以下几种:(一空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法,就是将经过脱水的样品,让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。
这种方法的最大优点是简便易行和节省时间;它的主要缺点是在干燥过程中,组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。
第二节透射电镜样品的制备一、表面复型和萃取复型技术（一）复型样品成像原理复型样品是一种间接试样，是用中间媒介物（碳、塑料薄膜）把样品表面浮雕复制下来，通过对浮雕的观察间接地得到样品表面组织形貌。
一定能量的入射电子照射到样品上要受到样品内原子核与核外电子的作用，产生弹性散射与非弹性散射。
非晶体复型样品成像主要取决于入射电子与试样中原子相互作用所产生的电子散射。
电子束穿过样品时在样品厚的区域或原子序数大的区域受散射程度大，反之则小。
这就是所谓的质厚衬度效应。
如果在样品下方加一光阑，那么散射角大于光阑孔径角的电子被光阑挡住或吸收，而不能穿过光阑孔参与成像。
散射角小于或等于光阑孔径角的电子就能穿过光阑孔参与成像，因此在荧光屏上就形成了明暗不同的衬度，产生了样品的图像。
图5—10为复型样品成像示意图。
（二）复型样品制备技术1．对金相试样的要求电镜的高分辨本领使它能够显示出金属组织的微细特征。
为使组织微细特征不在制备试样时失真，对图5—10 复型样品成像示意图金相试样的制备要求严格。
否则会造成假像影响对观察结果的分析。
试样要细心磨制，仔细抛光，力求避免产生微小的磨痕及变形层。
浸蚀剂与做金相试样时所用的浸蚀剂相同，浸蚀应浅些，这样可保留组织细节。
如果浸蚀过重就可能引起相界、晶界的过浸蚀，导致失真、脱落，甚至会出现腐蚀坑等假象。
2．AC纸的制作AC纸就是醋酸纤维素薄膜，是用6%醋酸纤维素丙酮溶液制作的塑料薄膜。
为了使AC 纸质地柔软、渗透性强并具有蓝色，在所配制的溶液中再加入2%磷酸三苯脂和几粒甲基酯。
待醋酸纤维素在丙酮中溶解后将其倒在干净、平滑的玻璃板上，倾斜转动玻璃板，使溶液均匀展开。
然后用玻璃钟罩扣上，让钟罩下边与下板间留有一定间隙以便于丙酮挥发。
大约经过24小时后AC纸干透，用小刀片轻划AC纸边缘，小心揭下即可。
3．塑料—碳二级复型塑料—碳二级复型由于其制备过程不损坏金相试样表面，重复性好，供观察的第二级复型—碳膜导电、导热性好，在电子束照射下较为稳定，因而得到广泛的应用。
