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凝胶色谱法的原理和目的
凝胶色谱法是一种分离和分析生物大分子的常用方法，其原理是利用凝胶（如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶）作为固定相，通过分子在凝胶中的大小和形状差异，使样品分子在凝胶中以不同的速率进行迁移，从而实现分离。
目的是通过凝胶色谱法可以实现以下几个目标：
1. 分离和纯化目标分子：凝胶色谱法可以将混合的生物大分子混合物分离成单一的成分，从而实现对目标分子的纯化。
2. 获得目标分子的大小和形状信息：不同大小和形状的分子在凝胶中的迁移速率不同，通过测定其迁移距离或迁移时间，可以获得目标分子的大小和形状信息。
3. 分析样品中不同组分的含量和相对分子量：通过凝胶色谱法可以定量分析样品中不同组分的含量，并通过与已知相对分子量的标准物质进行比较，可以得到目标分子的相对分子量。
总之，凝胶色谱法是一种用于分离和分析生物大分子的常用方法，既可以用于纯化目标分子，又可以获得目标分子的大小、形状以及相对分子量等信息。
凝胶色谱仪的主要功能
凝胶色谱仪是一种基于大小和电荷差异对样品进行分离的仪器。
它
的主要功能包括以下几个方面：
一、分离物质
凝胶色谱仪可以对多种不同的生物大分子进行分离，如蛋白质、DNA、RNA和多糖等。
在分离过程中，大分子会在凝胶中被分离成不同的组分，可以进一步鉴定和分析这些组分的结构和功能。
二、精确测量
凝胶色谱仪可以实现对溶液中微量杂质的测量。
通过光学检测器的测量，可以获得物质的浓度、分子大小、形状等信息，可精确测量目标
分子的含量和纯度。
三、高效分离
凝胶色谱仪的高效分离效率使得它被广泛应用于工业和生物医学领域。
高效分离使得在大量样品中得到目标物，同时排除其它干扰因素。
四、实时追踪
凝胶色谱仪在分离和检测的过程中提供多种实时监测功能，这些功能
包括样品进样、分离过程跟踪、路程记录、检查结果处理等。
通过这些功能，可对仪器的稳定性、分离效果、信号稳定性等进行实时监测和控制，确保数据的准确和精度。
五、其他
凝胶色谱仪还可以进行多种其他实验分析，如蛋白质定量、多肽打标等。
综上所述，凝胶色谱仪具有高效、准确、可靠、快速等优点，被广泛应用于化学、生物医学、环境科学等多个领域。
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
制备型凝胶渗透色谱法（Size-Exclusion Chromatography, SEC）是一种液相色谱技术，用于分
离和纯化各种大小的有机或无机分子。
该方法基于分子的大小和形状来分离样品，大分子不能通过凝胶而只能停留在凝胶床中，而小分子可以自由通过凝胶床，因此达到分离的效果。
制备型凝胶渗透色谱法在实验过程中需要注意以下事项：
1. 保证设备清洗干净：每次使用完制备型凝胶渗透色谱系统后，一定要用去离子水和异丙醇冲洗干净。
这样可以保证在下次使用时不会污染样品。
2. 保证样品纯净：在进样前，一定要保证样品的纯净，避免引入杂质。
3. 保证进样量准确：进样量一定要准确，否则会影响分离效果。
4. 保证操作规范：在操作过程中，一定要按照规范进行，避免出现操作失误。
制备型凝胶渗透色谱法在生物医药、高分子材料、纳米材料等领域都有广泛的应用，尤其在生物医药领域，它可以用来分离纯化蛋白质、多肽等生物分子，以及分离不同大小的核酸分子等。
凝胶色谱原理是什么
凝胶色谱是一种常用的分离技术，常用于生物大分子如蛋白质、核酸和多糖的分离纯化。
它利用不同生物大分子在凝胶柱中的迁移速度差异来实现分离。
凝胶是一种具有三维网状结构的物质，常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺（polyacrylamide）和琼脂糖（agarose）等。
凝胶柱是
由这些凝胶材料构成的柱状结构。
凝胶色谱的原理是利用凝胶柱中的孔道（空隙）来阻碍和分隔样品中的不同分子。
其中，孔径越小的孔道会更容易阻碍大分子的迁移，使大分子留在凝胶柱上；而孔径较大的孔道则更容易允许小分子迁移通过。
在凝胶色谱中，样品溶液被添加到凝胶柱的顶端，然后通过柱内流动。
不同大小的分子因为在凝胶孔道中的阻碍效应不同，会以不同的速度迁移通过凝胶柱。
这样，分子的大小决定了它们经过柱后的出现时间。
凝胶色谱的分离效果取决于凝胶材料的孔径大小和样品分子的大小。
通常，选择合适的凝胶材料和适当的操作条件，可以实现对多种不同大小的分子进行有效的分离。
总的来说，凝胶色谱利用凝胶柱中的孔径选择性地阻碍和分离样品中的不同分子，从而实现分离纯化的目的。
凝胶色谱法分离原理
凝胶色谱法（Gel Chromatography，GC）是一种定性和定量分析技术，用于分离复杂化合物中的性质相同或相近，或难以区分的组分。
它是将样品分散在凝胶基质（有机材料或无机材料）中，再以一定流速和浓度的溶剂进行缓慢的移动，使各种分子按其大小和亲合力对离子电偶极度以及其他有关因素，而在凝胶基质中分离和迁移，再经过检测，获得样品中各类成分物质的检测分析结果。
下面是凝胶色谱法分离原理：
一、凝胶色谱的基本原理
1 、凝胶色谱（GC）的原理是根据样品的分子大小和比重不同，在不同的凝胶相中的分布密度互不相同，将样品分散在凝胶基质中，经过一定的移动和积累而实现分离的。
2 、凝胶色谱的分离过程即按分子大小和比重的不同，在不同黏度或介电常数的凝胶相中以慢性分离的方式（通常为梯度流相分离），将分子分开，从而隔离分离不同分子组分。
二、凝胶色谱迁移原理
1 、凝胶色谱的样品分子在凝胶基质中的运动受到凝胶基质与溶剂耗散势所控制，通过在凝胶相空腔中形成液体膜上的均匀溶解才得以实现。
2 、凝胶色谱中，样品重性物质的运动速度更快，轻性物质的运动速度较慢，但同一样品中的各物质之间的运动速度差别很小，所以它们能在同一迁移时间内分离出来。
三、凝胶色谱检测原理
1 、在凝胶色谱的分离过程中，样品的各分子迁移到柱的不同位置，并发出不同的信号，检测系统根据这些信号就可以推测出样品中分子的种类、数量和浓度大小。
2 、样品分子通过一种叫做极性紫外分光光度计（PVOD）的检测装置获得，根据它的信号大小，就可以推测出样品中分子的浓度。
第九章凝胶渗透⾊谱讲解凝胶⾊谱分析⼆〇⼀⼀年九⽉九⽇第九章凝胶⾊谱分析凝胶渗透⾊谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），⼜称尺⼨排阻⾊谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）⽽实现物质的分离。
GPC可⽤于⼩分⼦物质和化学性质相同⽽分⼦体积不同的⾼分⼦同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透⾊谱是测定⾼分⼦材料分⼦量及其分布的最常⽤、快速和有效的⽅法[1]。
凝胶渗透⾊谱（GPC）的创⽴历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman⽤多孔离⼦交换树脂按分⼦量⼤⼩分离了苷、多元醇和其它⾮离⼦物质，观察到分⼦尺⼨排除现象；1959年Porath和Flodin⽤葡聚糖交联制成凝胶来分离⽔溶液中不同分⼦量的样品；1964年J. C. Moore将⾼交联密度聚苯⼄烯-⼆⼄烯基苯树脂⽤作柱填料，以连续式⾼灵敏度的⽰差折光仪，并以体积计量⽅式作图，制成了快速且⾃动化的⾼聚物分⼦量及分⼦量分布的测定仪，从⽽创⽴了液相⾊谱中的凝胶渗透⾊谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所⽰，⼀束光通过⼀间充满烟雾的房间，会产⽣光散射现象。
）⼴泛应⽤于⾼分⼦特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透⾊谱（GPC）分离技术相结合，可以测定⼤分⼦绝对分⼦量、分⼦旋转半径、第⼆维⾥系数，也可测定分⼦量分布、分⼦形状、分枝率和聚集态等。
⽬前，该技术在⾼分⼦分析领域已成为⼀种⾮常有效的⼯具，在美国，⽇本及欧洲⼴为使⽤，国内近年来亦引进了此项技术。
⼊射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透⾊谱分离原理让被测量的⾼聚物溶液通过⼀根内装不同孔径的⾊谱柱，柱中可供分⼦通⾏的路径包括粒⼦间的间隙（较⼤）和粒⼦内的通孔（较⼩）。
如图9-2、图9-3所⽰，当待测聚合物溶液流经⾊谱柱时，较⼤的分⼦只能从粒⼦间的间隙通过，被排除在粒⼦的⼩孔之外，速率较快；较⼩的分⼦能够进⼊粒⼦中的⼩孔，通过的速率慢得多。
附件凝胶过滤色谱系统（GFC-HPLC）1台主要性能参数要求具备分析和半制备功能，配备紫外、荧光、示差折光三个检测器，配备再循环组件和馏分收集器，其主要性能参数要求如下：1 溶液传输系统-泵系统脱气方式流速范围：0.001~20.000 ml/min流量准确度：±1%压力范围：1~40Mpa脱气方式：三路真空在线脱气2 进样系统进样模式：手动进样定量环配置：20，100，500，1000，5000μL3 检测器需配置紫外检测器、荧光检测器、示差折光检测器共三个检测器紫外检测器光源氘灯波长范围190-700nm波长准确性±1nm波长重现性±0.1nm 以下基线噪音±0.25×10-5Au基线飘移1×10-4Au/h流通池标准池：≤20μL，10mm光程，12MPa（同时配备制备池）功能190～700nm至少可任选双波长检测；最好能有波长扫描功能示差检测器折光指数范围1～1.75RIU检测范围分析方式：0.01~500×10-6RIU；制备方式：1～5000×10-6RIU噪声水平<2.5×10-9RIU飘移<100×10-9RIU/hr流通池≤10μL，2MPa；最大流速20mL/min荧光检测器光源150W 氙灯波长范围200-700 nm带宽15 nm( Ex/Em)波长精度±2 nm检测灵敏度蒸馏水拉曼峰S/N≥3004 再循环分离装置再循环洗脱容量≥35m L5 馏分收集器最大收集数144方式轴双向移动最大流量≥150m L/min纯度监视收集可根据检测信号进行收集6 色谱柱系统配置一套可放分析柱和制备柱的柱架，并可通过阀门切换分析和制备系统的流路硅胶基质和聚合物基质的GFC色谱柱各一套，每套含分析柱、等效制备柱、保护柱各1根色谱柱要求：线性范围1kDa~1000kDa（球蛋白）塔板数≥16000（分析柱）；≥12000（制备柱）耐受pH值硅胶基质不得低于7.4；聚合物基质不得低于10 分子量标准物：要求配置和色谱柱相匹配的蛋白标准品（IgM、Thyroglobulin、IgG、BSA等）。
凝胶色谱法凝胶色谱法是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，尤其适用于蛋白质和核酸的分离。
该方法基于样品分子在凝胶介质中的迁移速度差异，实现了不同分子间的分离。
原理凝胶色谱法的原理基于分子在凝胶介质中迁移的速度差异。
凝胶是一种高分子物质，可以分为聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等多种类型。
凝胶的孔隙大小决定了分子在其中的迁移速度，较大的孔隙适合分离较大分子，而较小的孔隙则适合分离较小分子。
样品被加载到凝胶柱或凝胶片上，然后通过某种方法施加电场或重力。
根据分子的大小和电荷等因素，样品分子会在凝胶中以不同的速度迁移。
较小的分子会更快地穿过凝胶，而较大的分子则会相对滞留在凝胶中。
这样，不同大小的分子就会被分离开来。
实验步骤凝胶色谱法的实验步骤如下：1.准备凝胶：选择合适的凝胶介质，根据需求制备凝胶柱或凝胶片。
2.加载样品：将待分离的混合物加载到凝胶柱或凝胶片上。
3.施加电场或重力：根据需要选择适当的方法，施加电场或重力使样品开始迁移。
4.迁移和分离：根据分子的大小和电荷，在凝胶中进行分离。
较小的分子会迁移得更快，而较大的分子会滞留在凝胶中。
5.结果分析：根据需要，可以使用染色或其他特定的方法来可视化样品在凝胶上的分离结果。
应用领域凝胶色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和分子生物学等领域，常用于蛋白质和核酸的纯化和分离。
具体应用领域包括但不限于以下几个方面：•蛋白质纯化：凝胶色谱法可以根据蛋白质的大小、电荷和亲水性等特性，实现蛋白质的纯化和分离。
•核酸分离：凝胶色谱法可以根据核酸的长度、序列和二级结构等特性，实现核酸的分离和纯化。
•生化分析：凝胶色谱法可以用于分析样品中的混合物，如酶活性检测、荧光标记分析等。
•质谱前处理：凝胶色谱法可以用于质谱前处理，如去除杂质、富集目标物等。
优点与局限性凝胶色谱法在生物大分子的分离和纯化中有许多优点，但也存在一些局限性。
优点：•高分辨率：凝胶色谱法可以实现较高的分辨率，因为凝胶提供了一种固定的介质，分子在其中以不同速度迁移。
Elite凝胶色谱系统
Elite常温及高温凝胶色谱系统能够快速可靠进行聚合物、塑料及树脂的分析，分析其分子量及其分布，对物理性质进行准确的预测。
聚乙烯、聚丙烯、聚酯及尼龙等样品需要在高温条件使之处于溶解状态进行分析，获得分子量分布等信息。
Elite凝胶色谱系统为常温和高温的分析系统，包括由高稳定恒流泵、检测器、凝胶色谱柱、色谱柱温度控制组件、凝胶色谱数据处理系统组成，根据需要可以灵活选择组合，满足各种不同类型样品的分析。
1．凝胶色谱分析系统
1.1高精度低脉动溶剂输送泵
高精度溶剂输送系统是分子量分布结果可靠性的保证，Elite P200II、P230高压恒流泵能够提供稳定的流速，保证GPC分析数据准确可靠；Elite P200II型高压恒流泵流速精度优于0.50%RSD，P230高压流泵流速精度优于0.20%RSD。
采用小凸轮驱动短行程柱塞设计的P230高压恒流泵极大地降低了传统液相色谱恒流泵的压力脉动，基本消除了示差检测器的基线噪声，提高了分析检测的灵敏度。
V
m
time (min)
图1 P230高压恒流泵与传统液相色谱泵对示差检测器基线噪声的影响对比
1.2高灵敏度检测器
高灵敏度的通用型示差折光检测器和紫外可见检测器能够满足不同样品分子量及其分布的分析；
SHODEX RI71型和SYKAM S3580型示差折光检测器，在测定高聚物时使用最多；UV200和UV230紫外可见检测器对紫外可见区存在吸收的样品有高灵敏度的响应。
1.3凝胶色谱填料和色谱柱
多种柱填料能够满足油溶性和水溶性高分子树脂和工程塑料，蛋白质、糖等不同性质高分子样品的分离分析。
TSK-GEL®和SHODEX®等国际著名品牌聚羟基甲基丙烯酸酯；硅胶；聚乙烯醇；苯乙烯二乙烯基苯高效凝胶色谱柱，孔径范围20~3000Å，可以满足从1千到几亿分子量范围的分析。
1.4凝胶色谱专用工作站
ELITE公司开发的凝胶色谱专用色谱工作站具有如下基本功能：
标样校正：根据单分散或宽分布标样的数均分子量或重均分子量或（和）分散系数，窄分布样品或未知样品的Mark-Houwink常数(k and a)计算校正曲线；任意数目标准样品和各标准样品多次平行进样的结果进行校正，消除实验误差；选择一次、二次或三次方程回归校正曲线，最小二乘法拟合并自动计算标准偏差和相关系数；同时获得由拟合曲线反推计算标准样品的平均分子量及误差，可直观判断拟合结果并随时修正。
分子量测定：由分子量校正曲线及峰切片面积计算高分子物质的数均分子量、重均分子量、Z均分子量、Z+1均分子量、粘均分子量等各种统计分子量及分散指数等；通过设置切片方法，可以对谱图中任意范围计算分析。
分子量分布：计算得到积分分子量分布曲线（累积重量分数分子量分布）、微分分子量分布曲线（包括微分累积分子数分数分子量和微分累积重量分数分子量分布）；可按照分子量、分子量对数及对数标度坐标系等三种方式显示分布图。
输出结果及打印：输出凝胶色谱分离谱图、校正曲线图、积分分子量分布曲线、微分累积分子数分数分子量、微分累积重量分数分子量分布曲线、各种分子量及相关参数计算结果；根据实验目的可采用峰切割法选择局部或全部范围计算、输出、打印结果；分子量计算结果表、分子量分布图（包括积分分布图和微分分布图）、分子量分布数据、校正曲线、标准品分子量数据可以发送到剪切板，然后使用相关软件（如Word、EXCEL 等）进行处理，具有极大灵活性；
双通道模式：双通道各自独立工作，可以同时进行常规色谱定性定量分析和凝胶色谱分析，也可满足两种不同检测器串联使用的凝胶色谱分析。
硬件24位高精度色谱数据采集卡，可以与各种型号的色谱仪联接使用，RS-232通讯方式与电脑联接。
1.5凝胶色谱分析标准样品
聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、多糖等不同性质和分子量范围的窄分布标准样品能够满足低、中和高分子量、油溶性和水溶性样品的凝胶色谱分离分析。
表1 凝胶色谱标准样品
种类MW范围
聚苯乙烯500 to 22,000
聚苯乙烯1,300 to 3,000,000
聚苯乙烯650,000 to 7,000,000
聚甲基丙烯酸甲酯200 to 1,500,000
多糖5,000 to 1,600,000
2．凝胶色谱系统应用
2.1校正曲线
图2 三次回归凝胶色谱标样的校正曲线
图3 四氢呋喃流动相时聚苯乙烯标准的校正曲线（线性回归）
拟合方程：MW=9.65241-0.68561V
相关系数： R=-0.99958
2.2不同分子量葡聚糖标样洗脱色谱图
68101214
15
4
32
1Retention time(min)
(a)
图4. 葡聚糖标准的色谱图 色谱柱：Shodex OHpak SB －803 HQ. 1. P-100; 2. P-50; 3. P-20; 4. P-10; 5. P-5;
表2. 葡聚糖和聚乙烯醇标准的分子量
标准品 Mw ·10-4 标准品 Mw ·10-3 P －100 11.2 PEG －10000 10 P －50 4.73 PEG －6000 6 P －20 2.28 PEG －2000 2 P －10 1.18 PEG －600 0.6 P －5
0.59
PEG －400
0.4
2.3不同检测器检测PEG 标样色谱图
68101214
6810121416
5
4
3
2
1
Retention time (min)
(c)
5
4
3
2
1
Retention time(min)
(b)图.5 两种检测器检测PEG 标准色谱图比较 (b)RI ；（c ）ELSD
色谱柱：Shodex OHpak SB －802.5 HQ.
1. PEG10000;
2. PEG6000;
3. PEG2000;
4. PEG600;
5. PEG400.
2.4流动相对标准样品保留的影响
表3 四氢呋喃和三氯甲烷流动相条件下聚苯乙烯的洗脱体积
基苯乙烯标准分子量
洗脱体积(ml)-THF
洗脱体积(ml)-CH 3CL
NO. 1 2 3 1 2
3
418 10.25 10.25 10.25 9.56 9.57 9.57 870 9.8 9.8 9.8 9.18 9.18 9.17 5970 8.62 8.62 8.62 8.08 8.10 8.09 9100 8.27 8.26 8.26 7.76 7.76 18100 7.87 7.87 7.88 7.40 7.38 7.39 37900 7.34 7.35 7.31 6.92 6.87 6.9 190000
6.42 6.4 6.41 6.04 6.03
6.04
试验条件:
仪器：P200II恒流泵，UV230紫外可见检测器，检测波长254nm；GPC专用色谱工作站色谱柱：SHODEX KF-804L色谱柱
流动相:四氢呋喃或三氯甲烷；流速1.0mL／min；
温度：室温
2.5应用实例
2.5.1 聚乙烯醇混合物的分离
30
20
V
m
10
051015
Time (min)
图6 聚乙二醇混合物的分离谱图
024681012
微分分子量
分布曲线（%）
分子量
020*********
积分分子量分布曲线（%）
图7 图6混合物的微分和积分分子量分布图
2.5.2 电镀液中聚合物的分离分析
图8 电镀液的凝胶色谱分离图
2.5.3 凝胶色谱分离芦荟浓缩液多糖
仪器：Elite P200Ⅱ高压恒流泵；Shodex RI －71检测器，SEDEX 55－ELSD 检测器。
色谱条件：流动相：蒸馏水；流速：0.8mL/min ；温度：室温。
药品：标准品水溶液浓度为0.1％，经0.45μm 滤膜过滤；芦荟浓缩液原液500倍稀释。
色谱柱 Shodex OHpak SB －803 HQ 色谱柱 Shodex OHpak SB －802.5 HQ
1015205
432
1
retention time (min)
(a)
681012
1416
retention time (min)
(b)
图9. 芦荟浓缩液在不同色谱柱中的分离色谱图比较
(a) Shodex OHpak SB －803 HQ; (b) Shodex OHpak SB －802.5 HQ
表4 芦荟浓缩液多糖在两种色谱柱上的V R 和 Mw
Shodex OHpak SB －803 HQ Shodex OHpak SB －802.5 HQ
V R （min ）
Mw V R Mw
1 7.87 5206 5.53 8077
2 8.51 1862 5.94 6029
3 9.16 60
4 9.30 37
5 4 9.49 228 9.75 279 5 9.85 190 10.22
177
6
10.60 121
2.5.4 蛋白质样品的分析
图10 蛋白质样品分析1
图11 蛋白质样品分析2。
