动物细胞的体外培养共52页

第一节动物细胞的生长特征
一、贴附生长
附着于一定的底物并伸展，是大多数体外培养细胞的基本生长特点。支持细胞生长的底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。培养细胞在未贴附于底物之前一般呈球体状，当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈上皮细胞样或成纤维细胞样等。细胞附着于底物并非是一种需能的过程，一般认为与电荷有关。一些特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连结素、Ⅲ型纤维、血清扩展因子等）可能参与细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面、培养基和血清之中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的球形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，进而细胞逐渐伸展成其原来的形态。另外，细胞的贴附和伸展，还受培养体系中的某些物理和化学因素的影响。如低钙离子浓度、高pH值、低温或培养基的流动过快等均可妨碍细胞的贴附。一般来说，除非是转化了的细胞或肿瘤细胞，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在培养基中悬浮生长而逐渐退变。
第三节 动物细胞体外培养的生长方式和条件
一、培养细胞的生长方式体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴附生长型细胞和悬浮生长型细胞两大类。１．贴附生长型细胞贴附生长型细胞指能附着于底物（支持物）表面生长的细胞。包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞都属于这一类型。当这类细胞从活体体内转移到体外培养时，必须贴附于底物才能生长。这些细胞在活体体内时，各自具有其特殊的形态，但是处于体外培养状态下的贴附生长型细胞则常在形态上表现为比较单一化而失去其在体内原有的某些特征，并反映出其胚层来源的情况。一般可将贴附生长的体外培养的细胞从形态上大体分为上皮细胞型和成纤维细胞型，还有一些难于确定其稳定形态的细胞。２．悬浮生长型细胞少数细胞类型在体外培养是不需要附着于底物而在悬浮状态下即可生长，来源于血液、淋巴组织的细胞、许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞均属于这一类型。这些细胞在悬浮培养中生长良好，可以是单个细胞或细小的细胞团，细胞呈圆形。由于细胞悬浮生长于培养基中，因此细胞生长空间大，具有能够提供增殖大量细胞、传代方便、易于收获的优点。

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3、细胞传代操作 （1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品 放入超净台进行操作。 （2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸 ，根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。 （3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新 鲜培养基进行传代，记录代次。 （4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密 切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此 熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。
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一、基本概念

1、细胞培养：动植物细胞在体外条件下存活和生长，此 时细胞不再形成组织，主要是指用来生产次生代谢产物为 目的的大规模细胞培养技术。 2、动物细胞体外培养的生长类型：贴附型和悬浮型。 3、动物细胞大规模培养技术：是建立在贴壁培养法和悬 浮培养法的基础上，融合了固定化培养、流式细胞术、生 物反应器技术等而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载 体培养、微囊化培养、中控纤维培养等。
液氮中长期保存。
温度降低原则：达到4度，然后达到-20度冷冻状态，再转移 到-70度，18h后，在液氮中保持。
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2、细胞复苏操作 （1）登记要取用的细胞。 （2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解 。

（3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合 适的离心强度。
（4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新 鲜培养基重悬后臵于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除 DMSO。 （5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。

化学限定培养基---不含蛋白水解物，均为已知化学结构。
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三、基本过程

1、从整个操作过程来说包括： （1）细胞小瓶培养---传代操作 （2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作 （3）细胞冻存和复苏---原则

时，就必须进行传代培养。
• 传代培养一般需要更换培养基，降低细胞 密度，在细胞培养的全过程中，此阶段的 持续时间最长。
• 传代的频率或间隔同培养基的性质、接种 的细胞数量和细胞增殖的速度有关，此期 如果维持良好的培养条件，细胞增殖旺盛， 并保持二倍体细胞的基本性状。
• （3）衰退或转化阶段：
• 体外培养的上皮细胞在此阶段不增殖或 增殖很慢，细胞形状紊乱，轮廓增强， 甚至出现细胞凋亡，这种现象多发生在 细胞传代末期。
• （3）特殊的培养基：
• 可用于上皮组织体外培养的培养基有 M199、RPMI1640、DMEM和F12。其 中M199、RPMI1640较为常用。
• 培养基中成分几乎包括所有氨基酸、维 生素、生长激素、脂类等营养物质。
• 由于许多上皮组织的体外培养都依赖于 血清才能生长，所以在培养时一般都要 在上述培养基中添加一定浓度血清。
• 以上是上皮细胞体外培养成功与否的关键。
• 1、上皮细胞体外生长的特殊条件
• 由于上皮组织的极性分化和与其他组织的 相互关系，以及体外培养环境同体内的差 异，因而还需要满足上皮细胞体外培养的 特殊条件。
• （1）防范微生物污染：
• 上皮组织的体外培养不仅要求在组织取材 时就严格灭菌，而且在分离、种植、培养 等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出 现的微生物污染。
• （4）去除成纤维细胞
• 体内的上皮组织借薄层基膜和结缔组织 相连。在分离细胞培养时，由于取材时 会带入少量结缔组织成分，常常造成成 纤维细胞与上皮细胞混杂生长。
• 由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附力 强的特点，很容易“疯长”为培养物中 的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细 胞的生长，成为细胞的污染源。
• 少数情况下，一些体外培养上皮细胞在 某种因素的影响下，细胞发生转化，上 皮细胞的接触性抑制特性消失，细胞获 得持久性增殖能力并保持细胞的某些相 关性状，及细胞的永生性。

低温保存
将细胞置于-196℃的液氮中长时间保存。
细胞复苏
从液氮中取出细胞，快速解冻后用培养基培养细胞，使细胞重新生长繁殖。
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动物细胞组织培养的实验操作
实验准备
培养基制备
准备适宜的动物细胞生 长的培养基，确保培养 基的营养成分、pH值和
渗透压适宜。
细胞来源
确保细胞来源可靠，并 经过必要的消毒和检测
异质性的原因
培养细胞异质性主要与细胞在生长和分化过程中 受到的微环境因素、基因突变等因素有关。
解决异质性的措施
采用标准化操作流程、优化培养条件、选用同质 化细胞系等方法，降低培养细胞的异质性。
动物细胞组织培养的前景展望
动物细胞组织培养在科学研究 、生物工程、医学等领域具有 广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和应用领 域的拓展，动物细胞组织培养 将迎来更多的发展机遇和挑战 。
细胞鉴定
通过形态学观察、免疫荧光等技术对细胞进行鉴定，确保细胞的种类 和来源。注意事项：选择适当的鉴定方法，确保准确性。
细胞观察与记录
定期观察细胞的生长状态、形态变化等，并记录数据。注意事项：保 持观察的连续性和准确性。
实验结果分析
细胞生长曲线绘制
根据观察数据绘制细胞生长曲 线，分析细胞的生长特性和规
律。
细胞形态学分析
观察细胞的形态变化，分析细 胞的分化、凋亡等情况。
基因表达分析
通过PCR、Western blot等技 术分析细胞中特定基因的表达 情况。
细胞功能检测
根据实验目的，对细胞进行特 定的功能检测，如药物筛选、
毒性测试等。
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动物细胞组织培养的挑战与前景
培养细胞的污染问题
污染来源

培养细胞的分化
❖不适应（Deadaption）
细胞在体内时所拥有的分化特性减 弱或不显。
❖脱分化（Dedifferentiation）
由于基因变异而使细胞失去分化能 力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基 酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
组织培养的分类及基本概念
分类:
1.组织培养(Tissue Culture) 2.细胞培养(Cell Culture) 3.器官培养（Organ Culture）
组织培养的细胞生物学特点:
1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不
完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节 和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生 变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism） 现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、 细胞趋单一化、不死性、恶性状。
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2) 指 数 生 长 期 （ Logarthmic growth phase）：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指 数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每 1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂 指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、 pH、温度等影响。
培养细胞的生长和增殖
1.原代培养（Primary Culture）阶段：或称 初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次 传代，随不同的组织时间长短不一，一般为 1~4w 2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培 养。也就是细胞系（Cell line）阶段，细胞增 殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。

④植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培 养物增长到一定程度后，也需要分割培养物为较小的部分再 培养。
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细胞体外培养的基本方法和过程
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二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture） １、取材及培养材料的制备 ２、分离（散）细胞的方法 ３、接种与培养过程 ４、更换培养液
课程安排及进度
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细胞体外培养的基本方法和过程
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注意事项：
1.网上没有名字的
同学请不要填报实
验课名单。
2.现在不能确定
自己时间的同学
不要填报，可以
下次上课时再报。
3.一旦填报就不能
实验课时间：从第14周开始
实验课地点：104馆三楼东边
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细胞体外培养的基本方法和过程
再更改时间。
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• 培养分离的细胞
细胞体外培养的基本方法和过程
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二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
１、取材及培养材料的制备：
关于取材：
（1)取材要准确：取材是体外培养工作的开端。如果在 这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个 体外培养过程就很难达到预期的目的。
原代培养，通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养
物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培
养过程。
原代培养的概念包含以下几方面含义：
①原代培养的实质就是初次培养，即培养物一经接种到
培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养物的生
长器皿；
②原代培养中的“代”并不是指细胞的“代”数，原代

细胞分裂
细胞分裂是指活细胞增殖及其数 量由一个复制最初的DNA分子， 使遗传信息传递给下一代，是保 证物种稳定的基础。
细胞培养的环境因素
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温度
维持一定的温度是细胞培 养的基本要求，因为温度 变化会影响细胞的生长和 代谢。
湿度
培养箱内的湿度应维持在 95%左右，以保证细胞的 正常代谢。
气体环境
细胞系建立与保存
筛选与鉴定
01
从原代细胞或传代细胞中筛选具有特定生物学特性的细胞系，
并进行鉴定。
细胞系建立
02
将筛选出的具有特定特性的细胞系进行培养，建立稳定的细胞
系。
细胞系保存
03
将建立的细胞系进行低温冷冻保存，确保细胞的遗传稳定性和
生物学特性。
细胞克隆技术
细胞克隆
在培养过程中，将单个细胞从群体中分离出来，并在培养瓶中形 成单克隆细胞群。
详细描述
异常的形态和功能可能是由于培养条件不适、基因突变等因 素引起的。为解决这一问题，需要密切观察细胞形态和功能 变化，调整培养条件，并采用适当的检测方法。
细胞传代过程中的变异问题
总结词
在动物细胞培养过程中，传代过程中可能会出现细胞变异问题，影响实验结果。
详细描述
变异可能是由于基因突变、染色体畸变等因素引起的。为解决这一问题，需要采用适当的检测方法，如基因突变 检测、染色体分析等，以确保细胞的稳定性和可靠性。同时，也需要优化传代方法，减少对细胞的损伤和变异的 可能性。
动物细胞培养(三佰)
• 引言 • 动物细胞培养的基本原理 • 动物细胞培养的过程 • 动物细胞培养的挑战与解决方案 • 动物细胞培养培养的定义
动物细胞培养是指在体外人工模拟体 内环境，将动物细胞种植在适宜的培 养基中，使其保持生长和繁殖的技术。

分批式
动物细胞 发酵工艺
半连续式
灌注式
连续式
细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断地加入反应器内，另 一方面又将培养液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞 处于不断的营养状态中。
不同培养工艺对tPA（人组织型纤维蛋白溶酶原 激活剂）的产量和活性的影响
培养工艺
分批培养 半连续式培养 灌注培养
3、中空纤维生物反应器
中空纤维生物反应器是个特制的圆筒，圆筒里面封装着数千
根中空纤维。
纤维是一种细微的管状结构，类似于动物组织内的毛细血管，
中空纤维的外径一般为100－500um，管壁厚度约50－75um，管 壁是极薄的半透膜，似海绵，富含毛细管。
在中空纤维生物反应器中就形成了两个空间：
④水解乳蛋白
由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。
优点是营养成分丰富、培养效果良好； 缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。
合成 培养基
根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体生存环
境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实 验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。
既能提供一个近拟于体内的生存环境，又便于控制
和提供标准化体外生存环境。
合成培养基种类很多，但一般都含有氨基酸、维生
素、糖类、无机离子和一些辅助性成分。
主要营养成份
①氨基酸
合成培养基的主要成分，以必需氨基酸为主，一般细胞仅能利用氨 基酸的L－型同分异构体。几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的 要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质。
②维生素
动 物 细 胞 的 大 规 模 离 体 培 养 技 术
引言 动物细胞培养方法、工艺及控制 动物细胞大规模培养反应器及改进 动物细胞的高密度培养

(微载体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不
断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体 为细胞提供了极大的附着表面, 1 g 微载体其比表面积
可达6 000 cm2 , 从而可实现细胞的高密度培养。
微载体的直径在60～250μm , 由天然葡聚糖、凝胶 或各种合成的聚合物组成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。 由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的 粘附特性, 在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质, 因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。采用微载体培养 具有以下优点: ①比表面积大, 单位体积培养液的细胞产 率高; ②采用均匀悬浮养, 无营养物或产物梯度; ③可用 简单显微镜观察微载体表面的生长情况; ④细胞收获过 程相对简单, 劳动强度小; ⑤培养基利用率高, 占地面积 小; ⑥放大容易, 国外已有公司以1 000 L 规模培养人的 二倍体细胞来生产β- 干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠 间的碰撞易损伤细胞; 接种密度高; 微载体吸附力弱, 不 适合培养悬浮型细胞。
胶囊化培养的优点是: ①可防止细胞在培养过程中受 到物理损伤; ②活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜, 从 而提高细胞密度和产物含量, 并方便分离纯化处理。缺 点是: ①微囊制作复杂, 成功率不高; ②微囊内死亡的细 胞会污染正常产物; ③收集产物必须破壁, 不能实现生产 连续化。
2. 固定化方法的选择
其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁, 因此两种类型的细胞都适
于培养。而且基质高度多孔, 允许大分子物质的自由扩散。但机 械强度差, 对剪切力很敏感。
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中空纤维
中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态, 利
用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢