4
Digital PCR技术原理
5
Digital PCR技术原理
在通常情况下,数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,这时需要采 用泊松概率分布公式(Poisson distribution)进行计算
上式中λ为每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数(浓度),p为在一定的λ条件下, 每个反应单元中所含k个拷贝目标DNA分子的概率。λ由样品的稀释倍数m决定,有λ=cm, 其中c为样品的原始拷贝数( 浓度) 。 当k=0(不含目标DNA 分子) 时,上式可简化为p=e - λ=e -cm ,p可以看作是无荧光信号的反应单元数与反应单元总数的比 值,即
其中,n为反应单元总数,f 为有荧光信号的反应单元数。 上式两边取对数(ln)得到 ,根据数字PCR 反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品
的稀释倍系数,就可以得到样本的最
Digital PCR
最初Vogelstein等提出的数字PCR是在96孔板中进行的。DNA模板被稀释成大 约平均每两个孔内有一个拷贝的浓度,在经过优化的实验条件下进行PCR扩 增。
3
Digital PCR技术原理
数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信 号分析。在PCR扩增阶段,数字PCR先将样品稀释到单 分子水平,再平均分配到几十至几万个单元中进行反 应。 与qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不 同,数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信 号进行采集,有荧光信号记为1,无荧光信号记为0,有荧 光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的。
PCR扩增
94℃ 94℃ 55℃ 70℃ 70℃
1min 15s 15s 15s 5min
60循环
8
他们设计了两种带有不 同荧光基团的分子信标 探针分别与PCR产物杂交, 其中一种探针可以与野 生型和突变型两种产物 杂交,另一种探针只与 野生型杂交,通过直接 计数每个孔内的荧光信 号得到同一样品中等位 基因(或野生型与突变型) 的数目和比值,并利用 统计学方法分析样品间 的显著性差异。