PCR引物设计软件介绍

一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200b p的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

Primer-BLAST是NCBI的引物设计和特异性检验工具。

Primer-Blast介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。

Primer-BLAST可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的 Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。

Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用 Primer3和NCBI BLAST更加准确。

Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。

跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。

在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。

可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。

如何设计PCR扩增引物1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采⽤primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度⼀般为15-30 bp，常⽤的是18-27 bp，但不应⼤于38，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进⾏反应[2]。

● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较⼤的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显⾼于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使⽤碱基A[3][4]。

另外，引物⼆聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。

5’端序列对PCR影响不太⼤，因此常⽤来引进修饰位点或标记物[2]。

● 4. 引物序列的GC含量⼀般为40-60%，过⾼或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太⼤[2][5]。

● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种⽅法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使⽤的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。

● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的⾃由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选⽤3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），⽽5’端和中间ΔG值相对较⾼的引物。

引物的3’端的ΔG值过⾼，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。

●7. 引物⼆聚体及发夹结构的能值过⾼（超过4.5kcal/mol）易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使PCR反应不能正常进⾏[8]。

●8. 对引物的修饰⼀般是在5’端增加酶切位点，应根据下⼀步实验中要插⼊PCR产物的载体的相应序列⽽确定。

PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。

而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。

本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。

一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。

PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，防止与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。

为了确保特异性，引物的设计中应防止高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。

（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。

另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。

（三）防止二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应防止引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。

二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。

因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。

（四）防止引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应防止以上状况的发生。

（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。

此外，引物的末端设计也要思量，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以便利后续的克隆操作。

二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以接受多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。

下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。

（一）序列比对法序列比对法是一种简易易行的PCR引物设计方法。

通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。

PCR引物设计及软件使用技巧张新宇，高燕宁*（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。

在PCR引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。

一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。

关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524To design PCR primers with Oligo 6 and Primer Premier 5Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021,China) Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.Key Words: PCR primer; design; usage skill;自从1985年Karny Mullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。

引物设计软件Oligo使用方法介绍荧光定量PCR仪|荧光定量PCR基因扩增仪作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能，如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：1、直接用键盘输入：a、点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；b、此时即可键入DNA序列；c、如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。

点击Edit菜单中的“Readback on”即可。

2、利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件。

html 格式，这个功能就显得很有用了。

在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。

当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。

3、如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA,GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。

点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。

进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6-碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6-碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA 时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5‘端稳定性是否稍高于3’端等。

一、普通引物对的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）为例。

1.安装软件Primer premier5.0。

程序下载：Primer Premier 5.0 /Soft/2005/114.htm 2.程序中双击打开3.点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。

4.输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

5.选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏6.选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶7.选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。

8.软件默认引物为25个碱基9.可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可10．在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。

11.选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。

如图，选中EDIT PRIMERS图标，开始设计反义链。

12.从3端删除7－9个碱基同正义链。

13.将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。

完成后点analyze，认为可以后点OK。

14.最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。

GC含量不应超过60％15.该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印16.如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。

同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。

点OK。

Primer Premier 4.10Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。

其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。

这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。

打开程序首先进入的是序列编辑参看，与Plasmid Premier相比，其多了一个语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快速。

点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。

该界面共分为四层，最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑；右边是观察两个引物在模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择；第二层是显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示；第三层是显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC％消光系数、简并性；最后一层是给出的有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测，左边是显示是否存在以上各种对PCR扩增有影响的结构，右边显示的是这些结构的位置，结构细节和稳定能，利用这些参数可以对引物作出可靠的评价。

下面是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。

并通过来点击按钮来设置一些搜寻参数：这些参数包括引物的Tm值，GC比，有简并性碱基，3’端稳定性，引物的稳定性，重复序列，二聚体/发卡结构和与模板及可能的杂质DNA（需要从另外的序列文件中读入）之间的错配情况，这些参数的设定可以根据要求变化，程序本身根据一定的标准分成从极高严谨性到极低严谨性5个档次。

常用生物学软件简介1. Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能： a) 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列。

b) 按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物。

c) 对环型DNA片段，设计反向PCR引物。

d) 设计多重PCR引物。

e) 为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现。

f) 分析和评价用其他途径设计的引物是否合理。

g) 同源序列查找，并根据同源区设计引物。

h) 增强了的引物/探针搜寻手段。

设计引物过程中，可以“Lock”每个参数，如Tm 值范围和引物3’端的稳定性等。

i) 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。

网址：/2． Vector NTI Suite是一套功能最全，而且界面最美观，最友好的分子生物学应用软件包。

主要包括四个大型软件，它们分别可以对DNA、RNA、蛋白质分子进行各种分析和操作。

Vector⑴ NTI：作为Vector NTI Suite的核心组成部分，它可以在生物研究的全过程中提供数据组织和序列编辑的软件支持。

Vector NTI 是以一种窗口形式，且支持项目组织的数据库来完成这一功能的；通过这个数据库，可以保存和组织大部分的实验数据，比如：基因结构、载体、序列片断、引物、蛋白质、多肽、电泳Markers和限制性内切酶等。

实际上，该数据库还支持对Vector NTI Suite 中各种小型的绘图和结果展示工具的管理。

Vector NTI 可以按照用户要求设计克隆策略。

用户只需提供克隆载体，外源片断序列，明确载体克隆的大致位置或酶切位点，其它工作由软件完成。

设计结果以图文形式输出到屏幕；最后根据客户定制的条件进行模拟电泳。

Vector NTI 还具有强大的设计和评估PCR引物、测序引物和杂交探针功能。

BioPlot⑵：BioPlot是一个对蛋白质和核酸序列进行各种理化特性分析的综合性工具，它是一种方便的桌面程序。

引物设计软件Primer5.0的操作（以小鼠GAPDH为例）：1、在NCBI上搜索该基因，选择Nucleotide，输入MUSS GAPDH。

2、找到该基因，点击打开基因信息。

3、点击进入CDS选项。

4、找到编码区所在位置。

在origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

5、打开Primer Premier5.0软件，File—New—DNA Sequence，将复制的序列拷贝进弹出的窗口(1)NewSequence中。

6、点击窗口中Primer，弹出窗口(2)Primer premier。

7、点击窗口(2)中Search，出现窗口(3)Search Criteria，按照图中设置各参数。

一般PCRProduct Size可以在80-300范围设置。

Primer length为20加减2bp。

8、在Search Mode中选中Manual，点击Search Parameters，弹出窗口(4)Manual SearchParameters。

修改默认值中的TM为59%-61%，GC为40%-60%，点OK。

9、直接再点击弹出窗口(5)Search Progress中的OK。

10、软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，自动跳出结果窗口(6)Search Result，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，分值偏高的比较好。

另外还有产物长度，Tm值等信息。

11、点击窗口(6)中的任何一个搜索结果，可以在Primer Premier引物窗口中会出现该对引物的详细综合信息，包括上游引物和下游引物的序列和位置等。

比如2号引物的PCR产物在220至656之间，点击S出现正向引物的信息，点A出现反向引物的信息，图中显示的是反向引物(AntiSense)的信息。

对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配；此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

第27卷 增刊V ol 27,Sup 广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric and Biol Science 2008年6月June,2008收稿日期:20080430。

基金项目:国家自然科学基金项目(30700599);广西自然科学基金项目(桂科青0728003);广西区教育厅科研项目(C150002);广西大学科研项目(DD150032)。

作者简介:磨美兰(广西大学副教授,博士;E mail:momeilan@gx u edu cn 。

文章编号:10083464(2008)增007204动物传染病研究中PCR 引物设计的技巧及相关软件介绍磨美兰1,甘书钻1,2(1 广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;2 广西区动物卫生监督所,广西南宁530001)摘要:引物设计是PCR 技术中最重要的一环。

本文就引物设计前的准备工作、引物设计原则、引物设计软件和方法等相关问题,介绍在动物传染病研究中设计P CR 引物的一些应用体会。

关键词:聚合酶链式反应;引物设计;技巧;软件中图分类号:Q524 文献标识码:ASkill of PCR primer design and primer design software in the studyof animal infectious diseaseM O M ei lan 1,GAN Shu zuan 1,2(1 Co llege of Animal Science and T echnolo gy ,Guang x i U niver sity,N anning 530005,China;2 Guang x i A nimal H ealth Inspectio n Institute,N anning 530001,China)Abstract:PCR primer desig n is the most im por tant step in polym er ase chain reactio n (PCR)technique Preparatio n befor ehand,the principal and metho d of PCR prim er design,the usag e skill of popular prim er desig n softw are and som e correlative m atter in the study of anim al infectious disease w ere introduced detailedlyKey words:PCR;pr im er desig n;skill;softw ar e聚合酶链式反应(Poly merase Chain Reaction;PCR)又叫体外基因扩增技术或无细胞分子克隆系统。

《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学和遗传学中常用的一种实验技术，它对于特定基因序列的克隆、分析、鉴定和扩增具有重要意义。

在PCR技术中，引物设计是一个关键的步骤，其成功与否直接影响着PCR反应的效果和准确度。

随着生物信息学的发展，引物设计软件为研究人员提供了更加方便快捷的途径。

本篇文章旨在研究并阐述如何利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计。

二、PrimerPremier5.0简介PrimerPremier5.0是一款专门用于设计PCR引物的软件，具有友好的界面和强大的功能。

它可以针对特定基因序列进行引物设计，同时还可以根据用户的需求进行参数调整，如引物的长度、GC含量、退火温度等。

此外，该软件还具有自动筛选和优化引物的功能，大大提高了引物设计的效率和准确性。

三、利用PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的步骤1. 打开PrimerPremier5.0软件，输入需要设计的基因序列。

2. 根据实验需求设置引物设计的参数，如引物长度、GC含量、退火温度等。

3. 软件将自动分析基因序列，并在可能的位置设计引物。

用户可以根据需要调整引物的位置和参数。

4. 软件将给出所有可能的引物组合，用户可以根据引物的质量、特异性等指标进行筛选。

5. 对筛选出的引物进行优化，如调整引物的长度、GC含量等，以提高PCR反应的效率和准确性。

6. 保存并导出设计的引物序列，用于后续的PCR实验。

四、注意事项1. 在进行引物设计时，应尽量选择特异性较高的区域进行设计，以避免非特异性扩增。

2. 引物的长度和GC含量应适中，以保证PCR反应的效率和准确性。

3. 退火温度是PCR反应中一个重要的参数，应根据引物的具体情况进行调整。

4. 在使用PrimerPremier5.0进行引物设计时，应遵循软件的操作指南，以保证设计的准确性和效率。