无机非金属材料扫描电镜的制样流程

扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。

二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。

取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。

三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。

四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。

2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。

样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。

如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。

3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。

4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。

5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。

6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。

扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。

二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

后固定：1% 锇酸固定液，固定1-2小时。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。

＊整个过程，样品不要暴露于空气。

1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。

四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。

五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。

用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。

玻片过大或者过厚影响观察效果。

2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。

3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。

离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。

样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。

将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。

5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。

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取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗
➢ 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品材料的生理值， 以免样品因环境突变而产生形变。
固定
➢ 选择方法：
脱水 ✓植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
✓动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
干燥
✓游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)；
粘样
（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。 样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率
镀膜 （6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、 组织液凝聚而影响观察效果。
镜检
通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力
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取材 三、固定方法
清洗 固定
1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
8000离心 2~5分钟
霉菌
切割菌落
戊二醛固定
常规固定 脱水干燥 粘样镀膜
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌10 μm 酵母菌5 μm
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曲霉20 μm
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第二节 特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
简易剖出法
切断法：多孔组织 掰开法：实质性组织 拉断法：纤维组织
（1）植物材料：根部水冲洗去泥土，地上部用水冲洗或滴洗。 观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。
（2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。
脱水 干燥
（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。 （4）游离细胞、微生物：离心法清洗。
清洗液与样品混合摇匀 低速离心（反复三次）

金属原子 “辉光放电” 不同角度覆盖样品表面
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。

子称吸收电子。吸收电子的信号强度与背散射
电子的信号强度相反，即背散射电子的信号强 度弱，则吸收电子的强度就强，反之亦然，所 以吸收电子像的衬度与背散射电子像的衬度相 反。通常吸收电子像分辨率不如背散射电子像，
一般很少用。
思考题
电子与固体试样相互作用还有哪种方式？
透射电子
如果试样适当的薄，入射电子照射 时，就会有一部分电子透过试样。 其能量大小取决于试样的性质和厚 度。所谓透射方式就是指用透射电 子成像和显示成分分析的一种工作 方式。
引
言
扫描电子显微镜的简称为扫描电镜，英文 缩写为SEM (Scanning Electron Microscope)。 SEM与电子探针（EPMA）的功能和结构基本 相同，但SEM一般不带波谱仪（WDS）。它 是用细聚焦的电子束轰击样品表面，通过电子 与样品相互作用产生的二次电子、背散射电子 等对样品表面或断口形貌进行观察和分析。现 在SEM都与能谱（EDS）组合，可以进行成分 分析。所以，SEM也是显微结构分析的主要仪 器，已广泛用于材料、冶金、矿物、生物学等 领域。
弹性或非弹性散射作用，并激发出反映试样
形貌、结构和组成的各种信息，有：二次电 子、背散射电子、阴极发光、特征X 射线、 俄歇过程和俄歇电子、吸收电子等。
入射电子
Auger电子
背散射电子
二次电子
阴极发光 X射线
样 品
透射电子
各种信息的作用深度
从图中可以看出， 俄歇电子的穿透深 度最小，一般穿透 深度小于1nm，二 次电子小于10nm。
样品制备简单
样品可以是自然面、断口、块状、 粉体、反光及透光光片，对不导电的样 品只需蒸镀一层20nm的导电膜。 另外，现在许多SEM具有图像处理 和图像分析功能。有的SEM加入附件 后，能进行加热、冷却、拉伸及弯曲等 动态过程的观察。

扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。

冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。

每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。

Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。

粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。

SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。

参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。

防止污染和氧化
保持清洁
在制样过程中，要保持样品和工具的清洁，避免引入污染物。
真空保存
将制备好的样品存放在真空环境中，以防止氧化和污染。
使用惰性气体
在需要的情况下，可以使用惰性气体（如氮气或氩气）来保护样 品，避免其与空气中的氧气或水分发生反应。
控制温度和湿度
恒温环境
在制样过程中，要保持恒定的温度，避免温度波 动对样品造成影响。
处理
对于某些难以清洁的样品，可以采用 适当的化学或物理方法进行处理，如 超声清洗、离子溅射等。处理后的样 品应保持干燥，避免受潮或污染。
02
扫描电镜制样方法
机械切割法
锯切
抛光
适用于较厚样品的初步切割，使用金 刚石锯片，注意控制切割速度和冷却 液的使用。
提高样品表面光洁度，常用抛光布和 抛光液，注意抛光时间和抛光液的选 择。
稳定性
样品在电子束轰击下应保持稳定， 不产生明显的形变或化学反应。
样品尺寸与形状
尺寸
通常要求样品尺寸在扫描电镜的 样品台范围内，一般直径不超过 30mm，厚度不超过5mm。
形状
样品形状应尽量规则，避免存在 尖锐边角或突出部分，以便于放 置在样品台上并保证成像质量。
样品表面清洁处理
清洁
样品表面应清洁无污物，避免尘埃、 油脂等杂质影响成像质量。
磨削
用于进一步减小样品尺寸和去除表面 粗糙度，可使用砂纸、砂轮等磨具， 注意选择合适的磨料粒度和冷却液。
化学腐蚀法
酸蚀
利用酸溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面氧化物和污染物，注意 选择合适的酸溶液浓度和腐蚀时
间。
碱蚀
利用碱溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面油脂和有机物，注意碱

扫描电镜实验步骤
扫描电镜是一种高分辨率的显微镜，可以用于观察微小的物体表面结构。

在进行扫描电镜实验时，需要按照以下步骤进行操作。

第一步：样品制备
样品制备是扫描电镜实验的关键步骤之一。

样品应该具有一定的厚度和尺寸，以便于在扫描电镜中进行观察。

通常情况下，样品需要进行固定、切片、染色等处理，以便于观察。

第二步：样品表面处理
在进行扫描电镜实验之前，需要对样品表面进行处理。

这是因为扫描电镜只能观察样品表面的结构，而不能观察样品内部的结构。

常用的样品表面处理方法包括金属喷镀、碳喷镀、真空蒸镀等。

第三步：扫描电镜操作
在进行扫描电镜实验时，需要将样品放置在扫描电镜的样品台上，并调整扫描电镜的参数，如电子束的加速电压、扫描速度、探针电流等。

然后，通过扫描电镜的探针扫描样品表面，将样品表面的结构转化为电子信号，并通过电子显微镜将其显示出来。

第四步：图像处理和分析
在获得样品表面的图像之后，需要对图像进行处理和分析。

常用的
图像处理方法包括增强对比度、去噪、调整亮度和对比度等。

而图像分析则可以通过计算机软件进行，如图像分割、形态学分析、三维重建等。

扫描电镜实验是一项复杂的实验，需要进行样品制备、样品表面处理、扫描电镜操作和图像处理和分析等多个步骤。

只有在严格按照实验步骤进行操作的情况下，才能获得准确的实验结果。

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

3。

1 试样制备技术试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。

如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果.和透射电镜相比,扫描电镜试样制备比较简单。

在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。

扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。

但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件,只简单地引用已有的制样方法是不够的.扫描电镜的特点是：①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。

②试样应具有良好的导电性能,不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。

③试样表面一般起伏（凹凸）较大。

④观察方式不同,制样方法有明显区别。

⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。

上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件.在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。

3。

1。

1 块状试样制备1．导电性材料导电性材料主要是指金属,一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。

这类材料的试样制备最为简单.只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm,最厚不超过20mm等)，然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好）,等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。

但在制备试样过程中，还应注意：①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。

②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。

《材料研究方法》课程演示实验报告冯恩科091623一、扫描电子显微镜1 实验的名称：场发射扫描电子显微镜（FESEM）。

2 仪器的型号：FEI—QUANTA 200F3 实验材料及样品形式：添加了缓凝剂的水泥，并水化三天，固体块状。

4 研究材料表观特性：研究样品表面微观形貌。

5 实验条件：保护气体：水蒸气；束斑：4.0；加压电压：20kV；气压：70Pa。

6 制样方法：先将导电胶或双面胶纸粘结在样品基座上，再用镊子将块状样品放置在胶带上面黏牢，最后镀上一层导电膜，然后就可以放入扫描室内进行观察。

7 所观察到的实验现象：上图为实验当天拍下来的两幅扫描图。

在实验中随着放大倍率不断提高，通过与扫描电子显微镜想连接的计算机进行聚焦后我们可以观察到，屏幕上出现一些棒状的物体（缓凝剂）、并且分布均匀，通过对这些凹凸和颜色的分析，可以确定表面物质组成和结构。

8 观后感：在观看实验之前，对扫描电子显微镜的理解和认识并不深刻，尽管知道它的一些原理和功能，但是它具体使用的方法是什么，如何利用这件宝贝看到自己想看的东西却完全不懂，通过这次实地地观摩和与老师的交流，终于明白一二。

老师给我们介绍了一些制样时需要注意的问题：通常要选取具有代表性的样品或样品区域，处理断面时应尽量选择新鲜自然形成的断面，避免人工手段对样品断面结构、物质造成变化而失真。

在处理样品时应防止电荷的积累，避免由此导致的表面过亮而使形貌特点难以观测。

粉末样品的颗粒应小而均匀，防止对观测产生不利影响。

在进行实验观察时，首先要弄清楚我们所要得到的信息，然后选择有代表性的区域，小心仔细地调节，由大到小，一步一步聚焦放大，直到看到想要看的区域为止。

二、红外光谱1 实验的名称：傅里叶变换<FTIR>红外光谱分析仪2 仪器的型号：EQUINOX 55配套OPUS软件。

生产厂家：德国BRUKER公司分辨率：< 0.5 1/cm波数精度：优于0.01 1/cm信噪比：>3600:1光谱范围：7500—370 1/cm功能及应用范围：主要应用于有机、无机材料的分子组成和结构检测主要附件：单反射ATR附件、漫反射附件、红外显微镜3 实验材料及样品形式：添加了3%高分子材料的水泥基，灰色粉末状。

扫描电镜检测的步骤及方法一、技术简介扫描电镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，它具有制样简单、放大倍数可调范围宽、图像的分辨率高、景深大等特点。

近年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、等学科的领域中。

主要是通过发射电子聚焦光束来扫描样品的表面形态.电子束与样品表面的样子发生作用，产生多种能够被检测的信号，这些信号就包含了样品的表面形态和组成染色。

二、实验流程1. 样品的初步处理a. 取材样品面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。

对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。

b. 样品的清洗(1)用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；(2)用5%的苏打水清洗；(3)用超声震荡或酶消化的方法进行处理。

c. 固定：固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。

由于样品体积较大，固定时间应适当延长。

也可用快速冷冻固定。

d. 脱水：样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。

2. 样品的干燥a. 空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。

这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。

因此，该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。

b. 冷冻干燥法(1)置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。

常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%-40%甘油水溶液。

(2)骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150℃的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。

(3)干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。

本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。

离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
实验十一 扫描电镜样品制备
选作
扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌 、割裂面结构、管腔内表面的结构等。
一、扫描电镜工作原理：
主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质 的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。
5. 置换乙醇
吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合 液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液， 加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。

扫描电镜制样步骤
生物样品（如动植物、细胞）需进行1-7步骤的操作（耗时长）
干燥的非导电样品（如花粉、制剂粉末、塑料等）无需进行1-5步骤操作而粘于样品台喷金再于电镜观察即可
导电样品（如金属样品）直接粘于样品台电镜观察，无需1-7步
注：取材时所需2.5%戊二醛溶液、0.1M PH7.0磷酸盐缓冲液需自行配置，配方详见《电镜固定液、缓冲液、染液配方》
送样前请先与我们联系以安排时间在我处制样。

生物样品制样耗时，请安排好个人时间
生物样品（小于1cm3）于2.5%戊二醛溶液4℃固定过夜，再按下列步骤操作：
1、漂洗：弃去戊二醛固定液，用0.1M PH7.0磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次15min
2、1%饿酸固定1-2h（通风厨操作）
3、漂洗：弃去饿酸固定液，用0.1M PH7.0磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次15min
4、梯度洗脱：50%、70%、80%、90%、95%系列浓度的乙醇溶液梯度脱水各15min，
再用100%的乙醇脱水2次每次20min
注：样品较大延长脱水时间
5、乙醇：醋酸异戊酯=1:1（V:V）处理30min，再用纯醋酸异戊酯处理1-2h
注：通风厨操作
相容性较差，需用醋酸异戊酯置换
乙醇、丙酮等脱水剂与CO
2
6、自然干燥/临界点干燥（英国EMTIECH K850）
7、日立E1010型离子溅射仪喷金30s，利用导电碳胶将样品固定于样品台，调节样品台高度，
8、日立S-3000N扫描电镜观察。

2干燥的方法
1空气干燥法 2）真空干燥法 3）冷冻干燥法 4）临界点干燥法
2干燥的方法
1）空气干燥法 方法：把样品放在空气中;让其中的脱水
剂自然挥发掉，以达到干燥的目的; 特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许
多样品发生变形或收缩，故本法是 在缺乏其他条件下不得已采用的干 燥方法。
2干燥的方法
PBS清洗3次;5~10min/ 次→ 乙醇梯度脱水到纯 乙醇，5~30min/级;
（3）脱水的要求
脱水要彻底；
严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保 持样品润湿，以免因表面张力变化而造成样品 的皱缩 塌陷或变形。
5 干燥
1干燥的目的 彻底去除样品中的脱水剂;使样品干 燥，以保护镜筒高真空和样品不变形;
2干燥的方法
4）临界点干燥法
① 临界点干燥的原理（图32）
图32 临界点干燥原理图
临界点干燥的原理之小结
临界状态的条件：密闭容器中的液体加热达到一定 的温度临界温度;
临界状态的特性：气 液密度相等;相界消失；液体变 成气体，液体的表面张力消失为零；无论施加多大 的压力，气体不会变成液体。
临界点干燥：利用临界状态下液体表面张力被消除 的特性，使样品中的液体气化而最后完全干燥。
作用：对二次电子进 行收集、放大和处理; 以调制显像管栅极电 压并成象。
图11 扫描电镜工作原理图
３电子偏转系统（扫描系统）
组成：扫描发生器 扫描线圈;
作用：使镜筒和显 像管内的电子束分 别进行同步光栅状 扫描;最后在显像 管的荧光屏上显示 出完整图象。
图11 扫描电镜工作原理图
2 影响图象形成的因素
② 临界干燥液的选择——置换液与中间液
置换液：在临界点干燥器内起临界干燥 作用的液体称为置换液表2;

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Polaron SC7620 “Mini” Sputter Coater
Options: CA0762F carbon fibre evaporation attachment
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Polaron SC7620 “Mini” Sputter Coater Options: CA7615 power supply - to run CA0762F carbon fibre carbon evaporation attachment
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Polaron SC7640 Auto / Manual High Resolution Sputter Coater Options: FT7607 FTM stage Quartz crystal
Note: centrally located crystal ensures representative reading
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Polaron SC7640 Auto / Manual High Resolution Sputter Coater Options: Water cooled stage
Not generally needed as the SC7640 head produces little or no heat.
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Polaron SC7640 Auto / Manual High Resolution Sputter Coater Standard universal stage - height adjustment
Standard stage and FT7607 FTM stage are height adjustable .

扫描电镜1.固定：用2.5%（动物）或4%（植物）戊二醛固定液于4℃下固定6h以上（昆虫样也可以：选用卡诺固定液固定12h保存于70%酒精或波恩式固定液固定4-24h），然后转到70%酒精的标本，在解剖镜下解剖，得到自己所要观察的结构。

注：如材料中有空气不能沉入固定液时，则在真空泵下抽气至样品沉入瓶底。

2.清洗：PBS(0.1mol/L磷酸缓冲液)漂洗三次，每次5-10min (视材料的厚薄而定)。

依据研究部位、结构的不同在用超声波清洗仪中清洗，一般20s-10 min 不等。

PBS漂洗的目的是洗去残留的戊二醛，防止戊二醛的存在与下一步的俄酸固定液发生反应而影响固定效果。

3.后固定：在用1%锇酸固定2小时（需放入4℃冰箱中）（此步可以省略。

）。

4.清洗：如果用锇酸固定了，就要用PBS漂洗三次，每次5-10min。

5.脱水和酒精：在10％、30%、50％、70％、80％、90％、95％的酒精浓度梯度液中逐级脱水各10-20 min，100％两次，每次20-30 min（可保存于70%酒精过夜）；在25％、50％、75％叔丁醇浓度梯度液中逐级脱酒精各15min （叔丁醇浓度梯度：无水酒精和叔丁醇体积比是3:1；1:1；1:3，目的是脱酒精），纯叔丁醇30-40 min。

6.冷冻干燥：纯叔丁醇加入放有样品的样品仓，注意加入纯叔丁醇要没过样品，干燥约3h。

7.粘台：将干燥后的样品利用双面导电胶在显微镜下粘到样品台上。

8.喷金：在真空喷涂仪内喷金。

9.观察与照相：在S-3400N型电子显微镜（加速电压5-15KV）下观察并数码拍照。

注意：1）卡诺氏固定液(Carnoy's Fluid)：配方（v/v）：3份无水酒精：1份冰醋酸适用于一般植物组织和细胞的固定，常用于根尖，花药压片及子房石蜡切片等。

有极快的渗透力，根尖材料固定15-20min即可，花药则需1h左右，此液固定最多不超过24h，固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止；如果材料不马上用，需转入70%酒精中保存。