微生物限度检验1概述：微生物限度检查方法包括直接接种法和薄膜过滤法。
饮用水，纯化水，注射用水、及其他完全溶解并能通过滤膜的样品，采用薄膜过滤法进行检查；精制卡介菌多糖核酸等其他不完全溶解或无法通过滤膜的样品，采用直接接种法进行检查。
2设备、仪器及用具2.1 设备净化工作台、生物安全柜、恒温培养箱(30～35℃)、霉菌培养箱(23～28℃)，恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱(180℃～300℃)、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、365nm紫外灯、显微镜、集菌仪、薄膜过滤装置等。
2.2 用具2.2.1 玻璃器皿用前应洗涤干净,无残留抗菌物质。
于180℃干热灭菌2小时以上或250℃干热灭菌30分钟以上（仅适用于玻璃器皿或不锈钢用具），或高压蒸汽121℃湿热灭菌30min,50～60℃烘干备用。
2.2.3 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套,用牛皮纸包严）、移液管、试管、接种环、孔径0.45UM且直径50的微孔滤膜灭菌,备用。
也可用一次性无菌口罩、手套。
2.2.3 酒精灯、乙醇棉球、打火机、实验记录纸等。
2.2.4经灭菌处理的用具存放时间不超过48小时，否则需重新灭菌后方可使用。
3稀释液 PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。
4培养基及试液4.1 细菌检查用酪蛋白大豆营养琼脂培养基。
4.2 霉菌、酵母菌检查用沙氏培养基、（玫魂红钠琼脂培养基）、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）。
4.3 大肠埃希菌检查用胆盐乳糖(BL)培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基、靛基质试液、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、枸橼酸盐培养基。
4.4 大肠菌群检查用乳糖胆盐发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基。
4.5稀释液 0.9%氯化钠溶液或PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液4.6 培养基制备应注意:4.6.1 配制的培养基应测定PH值，确保灭菌后培养基的PH值符合相关培养基的要求。
并且，不能有沉淀,如有沉淀,应于溶化后趁热过滤,灭菌后使用。
灭菌条件为：121℃蒸汽灭菌20分钟。
4.6.2 培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。
包装时塞子必须塞紧,免松动或脱落造成染菌。
4.6.3 培养基配制后应在2小时内灭菌,避免细菌繁殖。
4.6.4 灭菌后的培养基应保存在2～25℃避光的环境，有条件时置冰箱2～8℃保存备用,存放时间参照“微生物检验用培养基管理制度”里的相关规定。
放置时间不能过长,以免水分散失及染菌。
已熔化的培养基应一次用完,剩余的培养基不宜再用。
4.6.5 勿用电炉直接熔化琼脂培养基,以免营养成份过度受热而破坏。
宜用沸水浴或微波炉加热熔化琼脂培养基。
5供试品检验量5.1 细菌、霉菌、酵母菌检验量饮用水1ml/膜、纯化水 10 ml/膜、注射用水 800ml/膜；精制卡介菌多糖核酸 1ml/皿（相当于0.1g/皿、0.01g/皿、0.001g/皿等）5.2 大肠埃希菌检验量 10ML/瓶（相当于供试品1g、1ml、10cm2）5.3 大肠菌群检验量选择三个稀释度的供试液，每个稀释度加1ml供试品至乳糖胆盐发酵培养基试管中，每个稀释级平行做三管。
例：分别加入1:10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1:100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、 1:1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml）6试验前后的准备与清场6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿等经紫外线照射30分钟后移至无菌室内。
每次试验所用物品必须事先计划,准备足够用量,避免操作中出入操作间。
编号后将全部外包装(牛皮纸或锡箔纸)去掉。
6.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置,并使其工作不低于30min。
6.3 操作人员用肥皂洗手,关闭紫外杀菌灯,进入缓冲间,换工作鞋。
再用75%乙醇棉擦手,穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
6.4 操作前先用消毒液棉擦拭供试品瓶及开口处周围，经紫外线照射外表面30分钟后移入操作间。
6.5 生物安全柜清洁与灭菌6.5.1每次操作前应清洁卫生，然后用消毒液擦洗工作台面及一些可能污染的死角，开启紫外灯不小于60分钟后，再开启送风，启动净化设备，运转至少15分钟，方可进行相关操作。
6.5.2每次操作后，应清洁卫生，然后用消毒液擦洗工作台面及一些可能污染的死角，自净15分钟以上，关机，并开启紫外灯不小于30分钟，关闭电源。
与阳性对照菌相关的实验用品应及时进行消毒或灭活处理。
实验所用阳性对照菌菌种及菌悬液、洁净服等实验用具，应在121±0.5℃蒸汽灭菌至少30分钟。
7 细菌、霉菌及酵母菌的检验其方法包括直接接种法和薄膜过滤法。
根据检验需要，用稀释液将供试品溶解成（或稀释成）1:10、1:100、1:1000等稀释级的供试液。
7.1 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行微生物限度检查的供试品。
7.1.1 根据样品合格判断标准、菌数报告规则取相应稀释级（计数用理论有效稀释级包含在样品拟稀释级中）的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15-25ml温度不超过45℃的已溶化的培养基（为营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基），混匀，凝固，倒置培养。
每个样品至少有三个稀释级，每个稀释级每种培养基至少制备两个平皿。
7.1.2 阴性对照取试液用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
每种计数用的培养基各制备2个平皿，均不得有菌生长。
7.1.3 培养和计数细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间7天进行菌落数并报告。
注意：菌落蔓延成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌落数。
若同稀释级两个平板的菌落数均小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍以上。
在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。
然后将各种培养基上的细菌、霉菌、酵母菌数进行比较，经菌落数最高的培养基中的菌落数为计数结果。
7.1.4 菌落报告规则细菌、酵母菌宜选取菌落数小于300CFU的稀释级作为菌落数报告的依据。
霉菌宜选取小于100CFU的稀释级作为菌落数报告的依据，均取两位有效数字。
以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml、10cm2供试品中所含的菌落数。
如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌落数。
7.2 薄膜过滤法7. 2.1 滤膜的选择与处理：滤膜孔径应不大于0.45um，直径一般为50mm，使用时，根据供试品的特性选择滤膜的材质，并保证滤膜在过滤后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜；油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。
为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。
代试品经薄膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为50ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
饮用水、纯化水、注射用水的冲洗量为100ml/膜。
7.2.2 供试品的制备与抽取：取相当于每张滤膜含1g、1ml、10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。
若供试品每1g、1ml、10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml进行检查，用PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜。
7.2.3贴膜：冲冼后用无菌镊子取出滤膜，菌面朝上，贴于相应培养基的已凝固的平板上培养，每种培养基至少制备一张滤膜。
滤膜贴于平板上不得有空隙和气泡。
如有空隙和气泡，可用镊子尖背面轻轻压平或将气泡赶出。
但不得用力压，以免损坏培养基和滤膜。
7.2.4 阴性对照取试验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。
并每种贴膜用的同批次培养基平板各1个，与供试品培养平板同时培养，均不得有菌生长。
7.2.5 培养和计数培养条件和计数方法与直接接种法相同。
细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落数并报告。
注意：菌落蔓延成片的平板不宜计数,每片滤膜上的菌落数应不超过100CFU。
7.2.6 菌落报告规则以相当于1g、1ml、10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1乘报告菌落数（每张滤膜相当于1g、1ml、10cm2供试品），或以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌落数。
8 大肠埃稀菌检查8.1 对照用菌液取大肠埃希菌[CMCC (B) 44102]的营养琼脂斜面新鲜培养物培养物刮至0.9%氯化钠溶液，与标准菌液比浊管比较，然后用0.9%氯化钠溶液稀释，最终制成每1ml含菌数小于100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。
8.2 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml置于250ml三角烧瓶中，取1份培养基加入供试液10ml（相当于1g、1ml、10cm2供试品），其中1份另加入对照菌50-100个作为阳性对照，另1份加入10ml生理盐水作阴性对照。
置30-35℃培养18-24小时，必要时可延长至48小时。
8.3 取上述3份培养物各0.2ml，分别接种至含5mlMUG培养基的培养管内，于30-35℃培养5小时和24小时后，同时用未接种的MUG培养基做本底对照，将各管置365nm紫外灯下观察。
阳性对照呈蓝白色荧光，MUG阳性。
供试液MUG呈蓝白色荧光，MUG阳性。
无荧光，MUG 阴性。
观察后，沿培养基管的管壁加入数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红为靛基质阳性，呈试液本色为靛基质阴性。
本底对照管应为靛基质阴性。
8.4 结果判断阴性对照应澄清无菌生长，阳性对照应浑浊有菌生长；供试液MUG阳性，靛基质阳性，判断供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠埃希菌。
若MUG阳性，靛基质阴性或MUG阴性，靛基质阳性，均应取胆盐乳糖培养基中的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基平板或麦康凯琼脂培养基的平版上，于30-35℃培养18-24小时。
若无菌落生长或生长的菌落数与表1所列的菌落形态不相符，判未检出大肠埃希菌。
若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似,应挑选2-3个可疑菌落作靛基质试验(I)、甲基红试验(M)、乙酰甲基甲醇试验（V-P）枸橼酸利用试验（C）及革兰氏染色镜检。
按规定判断结果。
表1 大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂（EMB）紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。
