实验六_植物原生质体分离及融合

植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。

细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。

2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。

本实验用PEG诱导原生质体融和。

PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。

PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。

当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子。

Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。

高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。

PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。

二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。

（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。

（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。

（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。

实验六植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。

普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。

该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。

三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。

2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。

3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。

红辣椒800转/分离心5分钟。

4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗液，相同条件下再离心，弃上清液。

弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。

5、纯化：**蔗糖漂浮法去除碎片法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。

或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。

（以上任一方法皆能看到明显界面）(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。

注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。

Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。

原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。

b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。

二、实验原理：详见讨论。

三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。

四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。

ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。

iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。

iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。

500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。

v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。

vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。

b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。

ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。

iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。

实验七植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。

普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。

该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。

三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解0。

5小时。

2、用200目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。

3、在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。

红辣椒800转/分离心5分钟。

加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。

加1ml 13%CPW洗液悬浮。

4、蔗糖漂浮法去除碎片。

** 蔗糖漂浮方法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。

Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。

实验一荧光显微镜的原理和使用实验二叶绿体的分离与荧光观察实验三线粒体的活体染色与观察实验四细胞膜的通透性实验五 DNA的细胞化学——Feulgen反应实验六植物染色体标本的制备和观察实验七细胞计数实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察实验九植物原生质体的分离和活性鉴定实验十环境因素诱变染色体改组的观察实验一荧光显微镜的原理和使用一、实验目的了解荧光显微镜的构造及其维护方法；掌握荧光显微镜的使用方法和使用中的注意事项。

二、实验原理荧光显微镜是选择由高压汞灯或类似光源发出一定波长的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，观察细胞某种特异成分的分布状态的显微镜。

与普通光学显微镜一样，荧光显微镜也有物镜、目镜、调焦装置、光源、聚光器、载物台、镜身等组成部分。

所不同的是，荧光显微镜增加了激发光源和滤片系统，它投射到样品上的是特定波长的激发光而不是普通的可见光。

在激发光的作用下，样品中的荧光物质产生图1荧光显微镜发射光（即荧光）。

因此，荧光显微镜观察到的是样品中能产生荧光的部分所呈现的荧光映象，普通光学显微镜则是整个样品的可见光透射和折射影像。

某些物质在—定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。

若停止供能荧光现象立即停止。

有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。

因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。

三、实验用品荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸馏水、水葫芦叶片四、实验内容与方法（一）荧光显微镜的构造1、基本装置荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。

植物生理学实验指导目录植物材料的采集、处理与保存..................................... 实验一拟南芥种植和形态观察................................... 实验二植物细胞的活体染色和死活的鉴定......................... 实验三植物原生质体的分离和融合............................... 实验四植物叶面积测定原理、方法和步骤......................... 实验五植物细胞渗透势的测定（质壁分离法）..................... 实验六植物组织水势的测定（小液流法）......................... 实验七植物根系活力的测定（TTC法）............................ 实验八根系总吸收面积和活跃吸收面积的测定..................... 实验九离体叶绿体的制备以及完整度的测定....................... 实验十叶绿体色素的提取、分离和理化性质....................... 实验十一植物叶片光合速率的测定（改良半叶法）................. 实验十二氧电极法测定植物组织的光合与呼吸速率................. 实验十三小篮子法（广口瓶法）测定植物的呼吸速率. (37)实验十四谷物淀粉含量的测定（旋光法）......................... 实验十五类似生长素对种子萌发的影响........................... 实验十六赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成........ 错误！未指定书签。

实验十七植物种子生活力快速测定............................... 实验十八植物光周期现象的观察................................. 实验十九植物抗逆性的测定（电导仪法）....... 错误！未指定书签。

综合性（设计性）实验实验报告实验名称：原生质体的分离培养与融合姓名：马淑媛指导教师：卜婷专业：生物科学实验班级： 10级生物科学2班实验时间： 2012年11月16日实验地点：细胞学实验室成绩：__________________________植物原生质体的分离与融合及培养一实验目的1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

3、掌握原生质培养技术二试验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。

由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。

其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。

测定原生质体的活性有多种方法。

荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。

一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。

它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。

聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。

原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。

2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。

3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。

PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

三、实验材料、试剂与仪器1．材料新鲜的菠菜叶片2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。

（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。

（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。

实验六植物原生质体的分离与融合第一部分：综合性实验紫叶甘蓝与园葱原生质体的分离与融合一、实验原理及意义植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。

如果用近缘种内或种间的原生质体融合，可以获得稳定的、具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。

目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

1.酶：分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

2.渗透稳定剂：植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。

去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。

因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同。

3.植物材料：一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。

但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。

材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

4.酶溶液的pH值：对原生质体的产量和生活力影响很大。

一般为5~7。

酶的活性与pH值有关。

Onoznka纤维素酶R－10最适宜pH值为5~6。

不过实际上酶溶液的pH值经常调节4.7~6.0之间。

对于不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不同的，应通过实验确定。

5.温度：对酶解效率和植物原生质体的活力都有影响。

酶：40~50摄氏度，适于植物材料的温度一般都在25℃，所以一般在25℃左右进行酶解。

二、试剂的配制1、pH5.7的磷酸钾缓冲液10 mL：A液：称取0.272g KH2PO4（0.2mol/L，溶于蒸馏水中，定容至10 mL。

S11实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）原生质体培养的主要目的是实现远缘物种的体细胞杂交，外源染色体、DNA或细胞器的导入，创造新的远缘杂种。

全部技术环节包括原生质体分离、原生质体培养、体细胞杂交、杂种细胞产生愈伤组织及再生植株等。

一、原生质体的概念1、原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。

没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。

2、原生质体培养指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。

二、原生质体的分离方法1、机械分离法采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体。

特点是原生质体产量很低；方法繁琐费力；局限性大。

2、酶法分离采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。

三、原生质体纯化与活力测定1、原生质体的纯化a、离心沉淀法应用原生质体的比重大于溶液的性质，将原生质体沉于底部，收集原生质体备用。

b、漂浮法应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。

依次通过网筛过滤、离心、收集沉淀，再用蔗糖液洗涤离心2—3次，漂浮收集即可。

c、界面法选用两种不同渗透浓度的溶液，一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种小于原生质体的密度，进行界面收集原生质体。

2、活力测定a、形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的即为存活的原生质体。

b、染色识别用0.1%酚番红或伊凡蓝进行染色，后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。

四、原生质体的培养方法培养方法有四种，即固体薄层培养法、液体浅层培养法、双层培养法和琼脂糖珠培养法。

1、固体薄层培养法又叫平板培养法，指将一定体积的原生质体按照一定细胞密度与等体积的处于45℃的琼脂培养基混合，在培养皿内制成薄层固体平板的方法。

使原生质体位置固定，避免其游动，便于定点观察。