技能点3 细菌的分离培养及培养性状的观察
实训目标能对不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。
仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(疱肉)培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。
方法与步骤
一、细菌的分离培养
1．平板划线分离法平板划线是通过将被检材料连续划线而获得独立的单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落机会也愈多。
具体操作步骤如下：
(1)右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。
(2)无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。
(3)左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。
(4)将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30～40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。
在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与台面垂直且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。
(5)划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果。
凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。
2．倾注分离法取3支融化后冷至50℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物(或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h观察结果。
(实图6)
二、厌氧菌的分离培养
厌氧菌的分离培养常用肉渣汤(疱肉培养基)培养法。
先将试管倾斜，使培养基表面露出一点，然后接种被检材料或菌种，接种后将试管直立，即封闭液面。
最后置37℃温箱中培养24～48h。
三、细菌移植
1．斜面移植
(1)左手持菌种管及琼脂斜面管，一般菌种管放在外侧，斜面管放在内侧，两管口并齐，管身略倾斜，斜面向上，管口靠近火焰。
(2)右手拇指、食指及中指持接种环在酒精上烧灼灭菌。
(3)将斜面管的棉塞夹在右手掌心与小指之间，菌种管棉塞夹在小指与无名指之间，将二棉塞一起拔出。
(4)把灭菌接种环伸入菌种管内，挑取少量菌苔将其立即伸入斜面培养基底部，由下而上在斜面上弯曲划线，然后管口和棉塞通过火焰后塞好，接种环烧灼灭菌。
(5)在斜面管口，写明菌种名，日期，置37℃温箱内，培养18～24h，观察生长情况。
2．肉汤移植方法同上，取少许菌落，迅速伸入肉汤管内，在接近液面的管壁轻轻研磨，并蘸取少许肉汤调和，使菌混和于肉汤中。
3．从平板移植到斜面无菌操作打开平皿盖，挑取少许菌落移于斜面管，方法同上。
4．半固体培养基穿刺接种法方法基本同斜面移植，但用接种针挑取菌落，由培养基表面中心垂直刺入管底，然后由原线退出接种针。
四、细菌在培养基中生长特性的观察
1．琼脂平板培养基主要观察细菌在培养基上形成的菌落的特征。
(1)大小以直径(mm)表示，小菌落如针尖大，大菌落为5～6mm，甚至更大。
(2)形状有圆形、不整形、针尖状、露滴状、同心圆形、根足形等。
(3)边缘有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。
(4)表面形状光滑、粗糙、同心圆状、放射状、皱状、颗粒状等。
(5)湿润度湿润、干燥。
(6)隆起度表面隆起、轻度隆起、中央隆起、脐状、扣状、扁平状。
(7)色泽和透明度色泽有无色、白、黄、橙、红等；透明度有透明、半透明、不透明等。
(8)质地分坚硬、柔软或黏稠。
(9)溶血性菌落周围有无溶血环。
有透明的溶血环称β型溶血；呈很小的半透明绿色的溶血环称α型溶血；不溶血的为γ型溶血。
2．肉汤培养基：
(1)浑浊度有高度浑浊、轻微浑浊或仍保持透明者。
(2)沉淀管底有无沉淀，沉淀物是颗粒状或棉絮状等。
(3)表面液面有无菌膜，管壁有无菌环。
(4)色泽液体是否变色，如绿色、红色等。
3．半固体培养基具有鞭毛的细菌，沿穿刺线向周围扩散生长，无鞭毛的细菌沿穿刺线呈线状生长。
