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概述细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术.细菌在自然界中分布极广,数量大,种类多,它可以造福人类,也可以成为致病的原因.大多数细菌可用人工方法培养,即将其接种于培养基上,使其生长繁殖.培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用.细菌培养是一个复杂的技术. 培养方法以光合细菌培养方法为例.光合细菌培养的方法,按次序分为容器、工具的消毒,培养基的制备,接种和培养管理四个步骤.（一）培养基的制备1．培养用水如果培养的光合细菌是淡水种,菌种培养可用蒸馏水,生产培养可用消毒的自来水（或井水）配制.如果培养的光合细菌是海水种,则用天然海水配制培养基,注意在海水中加入磷元素时,不能用磷酸氢二钾,应用磷酸二氢钾,不然会产生大量沉淀.2．灭菌和消毒菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌.小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒.大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用.3．培养基配制根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方.按培养基配方把所需物质称量,逐一溶解,混合,配成培养基.也可先配成母液,使用时按比例加入一定的量即可.（三）接种培养基配好后,应立即进行接种.光合细菌生产性培养的按种量比较高,一般为20％～50％,即菌种母液量和新配培养液虽之比为1∶4～1∶1,不应低于20％,尤其是微气培养,接种量更应高些,否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势,影响培养的最终产量和质量.（四）培养管理光合细菌的培养过程中,管理工作包括日常管理操作和测试,生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面.1．日常管理和测试（1）搅拌和充气：光合细菌培养过程中必须充气或搅拌,作用是帮助沉淀的光合细菌上浮获得光照,保持菌细胞的良好生长.小型厌气培养常用人工摇动培养容器的方法使菌细胞上浮,每天至少摇动三次,定时进行.大型厌气培养则用机械搅拌器或使用小水泵使水缓慢循环运转,保持菌体悬浮.微气培养是通过充气帮助菌体上浮,因为培养液中溶解氧含量增加,光合细菌繁殖受到抑制,产量下降,所以必须严格控制充气量.一般采用定时断续充气,充气量控制在1～1.5升／（升?h）之间,溶解氧量保持在1×10-6以下.（2）调节光照度：培养光合细菌需要连续进行照明.在日常管理工作中,应根据需要经常调整光照度.白天可利用太阳光培养,晚上则需要人工光源照明,或完全利用人工光源培养.人工光源一般使用碘钨灯或白炽灯泡.不同的培养方式所要求的光照强度有所不同.一般培养光照强度应控制在2000～5000lx之间.如果光合细菌生长繁殖快,细胞密度高,则光照强度应提高到5000～10000lx.光照强度可通过调整培养容器与光源的距离或使用可控电源箱调节.（3）调节温度：光合细菌对温度的适应范围很广,一船在23～39℃的范围内均能正常生长繁殖,可不必调整温度.在常温下培养也可通过调整,将温度控制在光合细菌生长繁殖最适宜的范围内,使光合细菌更好地生长.（4）酸碱度的测定和调整：在培养光合细菌的过程中,必须注意酸碱度的变化.由于光合细菌的大量繁殖,菌液的pH值上升,这意味着光合细菌正处于指数生长期.但当pH值超过最适范围甚至生长的适应范围时,光合细菌的生长达到顶点,随后生长下降.如果能及时调整菌液的酸碱度,使pH值保持在最适范围,则光合细菌能继续生长繁殖.为了延长光合细菌的指数生长期,提高培养基的利用率和单位水体的产量,测定和调整PH值是非常重要的.一船采用加酸的办法来降低菌液的酸碱度,醋酸、乳酸和盐酸部可使用,最常用的是醋酸.在日常的管理工作中,必须每天或隔天测定菌液的pH值,当pH值上升超出最适范围,即加酸调整.如果在培养过程中不测定、调整酸碱度,当光合细菌的生长达到一定密度后pH值也上升到9以上,细菌生长受阻,此时应采收或再扩大培养.在培养过程中不调整PH值,获得的最终产量低.2．生长情况的观察和检查光合细菌生长情况的好坏是培养成败的标准.在培养过程中,可以通过观察菌液的颜色及其变化来了解光合细菌生长繁殖的大体情况,菌液的颜色是否正常,接种后颜色是否由浅变深,均反映光合细菌是否正常生长繁殖以及繁殖速度的快慢.必要时可通过显微镜检查,了解情况.3．问题的分析和处理通过日常管理、检测、检查,了解光合细菌的生长情况,就可以结合当时环境条件的变化进行分析,找出影响光合细菌生长繁殖的原因,采取相应的措施.影响光合细菌生长的原因很多,内因是菌种是否优良,外因是光照、温度、营养、敌害和厌气程度等.温度、光照和pH值都能影响着光合细菌的生长,而且温度、光照和pH值之间是互相制约的,温度与光照的强弱是对立统一的,所以光合细菌生长的最适条件应是互应的,即温度高,光照应弱；温度低,光照应强.如果是温度高,光照强,pH值就会迅速升高,培养基产生沉淀,抑制光台细菌的生长；如果温度低,光照弱,光合细菌得不到最佳能源,生长速度也慢.经试验得出光合细菌生长的最适条件是：①温度15～20℃时,光照30000～50000lx,培养基pH值为7.0；②温度25～30℃时,光照为3000～5000lx,培养基的pH值为7.0.。
细菌培养操作流程及评分标准细菌培养是微生物实验室中常见的实验技术，用于培养和繁殖细菌以便于进一步研究和分析。
本文将介绍细菌培养的操作流程，并提供相应的评分标准。
一、材料准备在进行细菌培养前，首先要准备好必要的实验材料和试剂。
材料包括培养基、琼脂糖平板、细菌液悬浮液、移液管、无菌培养皿、无菌棉签、无菌离心管等。
二、无菌操作细菌的培养需要在无菌环境下进行，以防止外界的污染干扰实验结果。
在进行任何培养操作之前，必须进行严格的无菌操作。
1. 准备好工作台，并进行无菌消毒。
注意避免打开实验室门窗，以减少外界微生物的进入。
2. 戴上无菌手套，并进行手部消毒。
使用酒精或消毒液彻底清洁双手，确保手部无菌。
3. 打开培养基和琼脂糖平板的包装，注意不要接触无菌培养基和琼脂糖平板的内表面，以免污染。
4. 打开细菌液悬浮液的盖子，在无菌条件下使用移液管吸取一定体积的细菌液悬浮液，并均匀地滴于琼脂糖平板上。
注意避免接触平板表面。
5. 使用无菌棉签将细菌液均匀地涂抹在平板上，确保细菌能够均匀分布。
6. 将含有细菌液的琼脂糖平板倒置，放入恒温培养箱中进行孵育。
设定合适的温度和时间以促进细菌生长。
三、培养结果评分培养后，可以根据细菌在琼脂糖平板上的分布情况和生长情况进行评分。
以下是常见的评分标准：1. 菌落形态评分：观察细菌在琼脂糖平板上是否形成菌落，菌落的大小、形状和颜色。
评分分为：优秀（菌落规则、边缘光滑、颜色均匀）、良好（菌落规则、边缘稍不光滑、颜色稍不均匀）、一般（菌落规则性差、边缘不光滑、颜色不均匀）和差（菌落不规则、边缘很不光滑、颜色不均匀）。
2. 生长情况评分：观察菌落的生长情况，包括生长速度和菌落的密度。
评分分为：优秀（生长迅速、菌落密度高）、良好（生长较快、菌落密度中等）、一般（生长较慢、菌落密度较低）和差（生长缓慢、菌落密度很低）。
3. 杂菌评分：观察琼脂糖平板上是否有其他非目标细菌的污染。
评分分为：无污染、轻微污染、明显污染和严重污染。
细菌的培养一、制定方案当我们获得一株菌，在进行复苏活化之前，首先要了解菌株的生长特性，确定菌株的营养需求、生长温度、气体环境、渗透压、酸碱度及嗜盐性等条件，选择合适的培养基和培养环境，制定复苏活化方案。
通常从菌种保藏中心购买的菌株都附带说明书，按照说明书进行操作即可。
若没有说明书，可通过查阅文献等方式确认菌株的生长条件，再制定方案。
二、菌株处理及接种操作获得菌株后，原则上应尽早进行活化和保存。
若不能立即活化，应按照说明书放入相应的环境中进行保存。
(1)若保存的菌株为冻干粉形式或载体保存形式，可加入少量生理盐水或非选择性肉汤培养基进行溶解悬浮，用划线或涂布方式接种至平板，或吸取菌液至液体培养基中进行培养。
(2)若保存的菌株为甘油冻存或液体保存形式，可在室温速融后划线或涂布接种至平板，或直接加入到液体培养基中进行培养。
(3)若保存的菌株为瓷珠形式，可以挑取单个瓷珠在平板.上滚动数次或直接加入到液体培养基中进行培养。
(4)若保存的菌株为斜面或半固体形式，可直接挑取菌落转接至平板或液体培养基中进行培养。
三、培养基的选择活化菌株使用的培养基的成分通常包括以下几个组分: (1) 基本营养成分，如蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉等，主要提供碳源、氮源及微量元素等; (2) 氯化钠:维持一定的渗透压环境; (3) 磷酸盐:维持pH的相对稳定; (4) 特殊成分:如血清、半胱氨酸、氯化血红素等，促进特定菌的生长。
根据菌株的生长特性，选择合适的培养基或对特定的培养基添加成分进行改良，以满足菌株的生长需求，常用活化培养基有以下几种:(1)胰酪大豆胨液体/琼脂培养基、营养肉汤/琼脂培养基、脑心浸液肉汤/琼脂培养基:营养丰富，适用于多数常见细菌的复苏活化培养。
注:可在培养基中加入血液、血清、维生素、氯化血红素等成分增加营养，培养一些营养苛求的细菌。
(2)血平板:可使用血液琼脂基础加入5%-10%的脱纤维羊血或兔血，也可使用TSA或BHI等培养基做为基础加入5%-10%的脱纤维羊血或兔血制成血平板，可以培养一些营养要求较高的细菌，如弯曲菌、嗜血杆菌、奈瑟氏菌、梭菌、链球菌、螺杆菌等。
细菌的培养与分离技术● 考点◇ 基本条件◇ 细菌的接种与分离技术◇ 细菌培养的方法◇ 细菌的生长现象◇ 细菌L型的检查【内容讲解】细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。
分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。
一、基本条件（一）细菌实验室（二）无菌实验室（三）基本设备和器具（一）细菌实验室标本接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。
对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。
超净工作台应选择垂直气流通风方式。
6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸气灭菌器、干烤箱；冰箱和冷藏柜；接种器具，包括接种环和接种针；pH计；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
细菌的分离培养技术一、常用培养基的制备（一）肉膏汤培养基 (broth medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)于1000ml蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。
(2)调整pH为7.4～7.6，煮沸3～5min，用滤纸过滤。
(3)分装于适当容器内，高压灭菌103.43Kpa 20min ,置阴暗处或冰箱中贮存备用。
3、用途供一般细菌培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。
（二）肉浸汤培养基(infusion medium)1、成分⑴新鲜牛肉(去脂绞碎)500g 蛋白胨10g⑵氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)取新鲜牛肉(兔肉)除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎或用刀剁碎，置于糖瓷或铝制锅中，每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中过夜。
(2)次日取出肉浸液，搅拌均匀，煮沸30min并常搅拌以免沉淀烧焦。
如蛋白质已凝固，即停止加温，补足失去水分。
(3)用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。
(4)在滤液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化钠(5g/L)，再加热使其全部溶解。
(5)调整pH至7.6～7.8，煮沸10min，以滤纸过滤。
(6)分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌103.43KPa 20min，冷却后置阴暗或冰箱中保存备用。
3、用途供作基础培养基用，营养较肉膏汤好。
一般营养要求不高的细菌均能生长。
（三）普通琼脂培养基(agar medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20～25g蒸馏水1000ml2、制法⑴将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解(须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。
⑵趁热调整pH至7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌103.43KPa 15min。
⑶琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭菌的试管内，斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。
细菌培养的一般方法
细菌培养的一般方法包括以下步骤：
1. 准备培养基：选择合适的培养基，例如琼脂（agar）培养基或液体培养基。
根据需要添加适当的营养物质和抗生素。
2. 杀菌处理：将培养基加热至沸腾以杀灭其中的细菌，然后冷却至适宜的温度。
这一步骤旨在防止未知细菌干扰所要培养的目标细菌。
3. 接种：将所需的细菌种或培养物转移到已准备好的培养基上。
可以采用划线法在琼脂平板上涂抹培养物，或在液体培养基中接种适量的细菌培养物。
4. 培养条件：根据不同的细菌种类和生长条件，选择适当的温度、湿度和氧气浓度来培养细菌。
通常在恒温培养箱中进行培养。
5. 培养时间：根据目标细菌的特性，确定合适的培养时间。
有些细菌需要较长时间才能形成可见的菌落，而其他一些细菌则可能在短时间内迅速生长。
6. 观察和记录：在培养完成后，观察所形成的菌落或细胞形态，并记录相关的观察结果。
这些数据可以用于进一步的细菌鉴定或研究。
需要注意的是，细菌培养需要严格的无菌技术和操作程序，以确保所培养的细菌
种群不受外界的污染。
细菌培养的常用方法细菌培养是在实验室中培养和繁殖细菌的一种常用方法。
通过细菌培养，科研人员能够获取大量的细菌菌株，用于实验研究、药物研发和一些工业生产等领域。
本文将介绍细菌培养的常用方法及其步骤。
首先，细菌培养需要准备培养基。
培养基通常包含了有机氮源、有机碳源、矿盐和生长因子等成分。
这些成分能够提供细菌所需的营养物质，促进其生长和繁殖。
根据不同菌株的需求，培养基的配方会有所调整。
在准备好培养基后，接下来需要进行灭菌处理。
灭菌的目的是杀死培养基中的其他微生物，确保培养的细菌为单一纯种。
常用的灭菌方法包括高温灭菌、压力灭菌和化学灭菌等。
高温灭菌一般在121摄氏度下进行15-20分钟，可有效杀死大多数常见的细菌和真菌。
当培养基完成灭菌后，可以开始接种细菌。
接种方式主要有平板法、液体培养法和固体培养法。
平板法是将培养基倒在平板上，待其凝固后，用接种环将细菌接种在培养基表面。
液体培养法是将培养基倒入培养瓶中，通过搅拌或震动方式将细菌均匀分散在培养基中。
固体培养法是将培养基加入试管或培养皿中，待其凝固后，将细菌接种在培养基表面。
接种完成后，需将培养基置于恰当的培养环境中，以促进细菌的生长。
培养环境通常包括温度、湿度、光照和氧气等因素。
不同的菌株对这些环境要求各不相同，因此在培养细菌前需要了解其生物学特性。
细菌培养的最后一步是培养基的保存与维护。
培养基的保存方式包括冷冻保存和冷冻干燥保存等。
冷冻保存是将培养基和细菌储存在低温下，常见的储存温度为-80摄氏度。
冷冻干燥保存是将培养基冷冻后，通过真空脱水将水分去除，以延长培养基的保存时间。
除了上述常用的细菌培养方法，还存在一些特殊的培养技术，如微生物筛选技术和纯化技术等。
微生物筛选技术是利用高通量筛选系统，对微生物进行快速筛选和筛选结果分析。
纯化技术是对细菌进行纯化和鉴定，以获得纯种菌株。
细菌培养的常用方法不仅在科学研究中起着重要的作用，也在医学、食品工业和环境监测等领域有着广泛的应用。
细菌培养技术目的：无菌操作接种、培养是细菌学实验室中最基本、最重要的操作技术，它是鉴定细菌的首要前提。
器材：酒精灯、95%酒精、接种环（针）、培养皿（瓶）、烛缸、火柴等。
一、无菌操作技术的基本要求1、临床细菌检验的所有操作，均必须在无菌条件下进行，即在酒精灯火焰附近或在超净工作台内进行。
2、由临床标本或培养物中取材作检查时，必须使用接种环（针），使用前后均需火焰灭菌。
3、从培养瓶或试管培养物中取标本时，在打开瓶口、试管口或关闭前，均要在火焰上通过1—2次，瓶塞或试管塞用无名指及小指夹住，操作完毕后塞回。
4、不慎打破培养物瓶（管）时，应报告负责人后，用0.2%消毒灵处理污染的台面或至少覆盖30分钟。
打破的器皿集于容器内高压灭菌，台面及地面再进一步消毒清洗。
5、工作完毕后，实验台用0.2%消毒灵擦拭，双手用0.2%消毒灵浸泡，再用肥皂和清水刷洗干净。
.二、接种方法（一）平板接种法：平板划线接种是细菌分离培养的常用技术，主要使标本或培养物中的混合细菌能在培养基表面分散生长形成单个菌落。
1、曲线划线分离法：接种环菌灭后挑取标本或菌液少许呈45度角，在平板1/5处轻轻涂布，然后左右来回以曲线形成划线接种，倒置37℃温箱内培养24h后观察结果。
2、分区划线分离法：接种环于平板内分划五区，每划完一个区域烧灼环一次后倒置35—37℃培养。
（二）穿刺接种法：多用于保存菌种观察动力及做厌氧培养，亦可用于观察细菌对糖类的分解反应，培养基为半固体。
方法：1、左手持细菌培养物。
2、右手持接种针酒精灯上烧灼，冷却后挑取细菌。
3、左手持半固定培养基，右手小指夹住棉塞并取下，管口火焰灭菌，将接种针插入培养基中央，穿刺近底部1/3处，再沿原穿刺线抽出在斜面上做连续曲线接种。
4、试管口在火焰上充分灭菌，塞棉塞，灭菌接种针。
6、接种后的半固体培养基，置试管架上，35—37℃孵育箱培养三、培养方法（一）一般培养法（又称需氧培养法）：将已接种好的平板、斜面和液体培养基等，置35—37℃孵育箱中18—24h，难以生长者培养2—7天甚至半个月。
第二节细菌培养检测技术节概述细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。
大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定知识点导航一.培养基的种类培养基（culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。
适宜的培养基能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。
可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。
（一）基础培养基只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉汤培养基、琼脂培养基。
（二）营养培养基在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细菌生长需要或增菌用。
如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。
（三）选择培养基利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的培养基。
培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别。
选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。
（四）鉴别培养基培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴别和鉴定细菌。
（五）厌氧菌用培养基专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。
（六）特殊培养基为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。
如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。
二.培养基的制备制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH、过滤、分装、灭菌及检定和保存。
三.细菌检验室的注意事项及无菌技术细菌培养必须随时为防止污染和病原菌的扩散而进行操作，即无菌操作。
细菌检验室的注意事项如下：1．细菌的培养应在接种罩或无菌室内进行。
有条件的实验室可在超净工作台内进行。
2．用接种环分离和移种细菌时，用前用后均需灭菌处理。
一般采用火焰灭菌法。
3．从培养瓶或试管培养物中取标本或移种时，在打开瓶口、管口或关闭前，均要在火焰上通过2～3次。
切不可将含菌材料污染台面和其他物体。
4．如不慎将试管等打破造成菌液污染时，不要惊慌，应立即报告负责人，然后用3％来苏或5％石炭酸处理污染台面或地面，至少浸泡30分种。
5．工作完毕后，用紫外光灯照射30分钟，或用3％来苏擦拭台面，并清洗双手。
四、接种环和接种针使用接种环和接种针由三部分组成，即环（针）部分、金属柄部分和绝热柄部分。
接种环和接种针通常选用电热（镍）丝，环的直径随使用目的而不同，一般多为2～4mm，环和针的长度为40～50mm。
接种环（针）使用前后均应进行灭菌处理，将接种环（针）末端直立火焰中，烧红镍丝部分，再使接种环（针）金属柄旋转通过火焰3次灭菌，冷却后用以取菌或待试标本。
使用接种环（针）完毕后立即将染菌的镍丝部分于还原焰（内焰）中加热，烤干环（针）端附着的细菌或标本，以免环（针）上残余的细菌或标本因突受高热，爆烈四溅，而污染环境和导致传染危险。
然后再移于氧化焰（外焰）中烧红灭菌，最后将金属柄部分往复在火焰中通过3次。
用完后的接种环（针），应立即搁置于架上，切勿随手弃置，以免灼焦台面或其他物件。
五、接种操作区为避免在接种过程中污染环境以及空气中的细菌污染培养物，接种均应在接种罩或无菌室内进行，此外细菌学实验室所必需的设备还包括无菌工作台、生物安全柜和生物安全实验室。
（一）接种罩接种罩的式样很多，可用木框和玻璃制成，亦有用有机玻璃制成。
接种罩在用前先以3％石炭酸或来苏轻拭，内需装有紫外线杀菌灯，用前可先行照射，以保证罩内无尘埃和细菌。
操作结束后，应立即清理内部，并作罩内消毒处理。
（二）无菌工作台又称超净工作台（super clean bench），目前多采用垂直层流的气流形式。
通过变速离心风机将负压箱内经过预滤器过滤的空气压入静压箱，再经高效过滤器进行二级过滤，从出风面吹出的洁净气流，以一定的和均匀的断面风速通过工作区时，将尘埃颗粒和微生物颗粒带走，从而形成无尘无菌的工作环境。
使用时应提前50分钟打开紫外线杀菌灯，30分钟后关闭并启动送风机。
净化区内严禁存放不必要的物件，以保持洁净气流型不受干扰。
（三）无菌室无菌室又称洁净室（clean room），是在实验室内部安装的用于无菌操作的小室。
室内应有空气过滤装置、紫外线杀菌灯等。
（四）生物安全柜（biological safety cabinet，BSC）目前微生物试验中多采用生物安全柜，是为操作原代培养物、菌（毒）株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的负压过滤排风柜。
（五）生物安全实验室（Biosafety Laboratory），简称“BSL实验室”，是指通过规范的实验设计、实验设备的配置、个人防护装备的使用等建造的实验室。
在结构上由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（设施）构成，实验室生物安全防护的安全设备和设施的不同组合，构成了四级生物安全防护水平，一级为最低。
六、接种法根据待检标本的性质，培养目的及所用培养基的种类，采用不同的接种方法。
常用的有平板划线分离培养法、斜面接种法、液体接种法和穿刺接种法。
（一）平板划线分离培养法分离培养法就是通过划线使标本或培养物中混杂的多种细菌在培养基表面逐一分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。
分离细菌最常用的为平板划线分离法。
1．将接种环火焰灭菌，待冷却后取标本或混合菌液。
2．用左手持起平板，使平皿盖向上放于台面上或打开平皿盖。
3．左手斜持（45℃角）平板，右手持已取材的接种环，在酒精灯上方5～6cm处作连续划线法分离细菌。
划线时，接种环与平板呈30～40°角，轻轻接触平板，以腕力平行滑动接种环。
应避免将琼脂划破。
先在平板上l／5处轻轻涂布，然后即可左右来回以作连续划线接种，线与线间留有适当距离，做到线密而不重复，将整个平板表面布满划线。
如果菌量较大可采用分区划线法。
可将平皿分为若干个区（一般为5个区）。
先在平板上l 区轻轻涂布，再在2，3……区划线。
每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，冷后再化下一个区域。
每一区域的划线均接触上一区域的接种线l～2次，使菌量逐渐减少，以获得单个菌落（见图20-1）。
图20-1细菌分离接种法4．划线完毕，盖好皿盖，做好标记将平皿倒置，置37℃培养18～24小时后观察结果。
（二）斜面接种法主要用于划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以得到纯种细菌和保存菌种，以及观察细菌的某些培养特性。
1．取菌种管置左手食指、中指、无名指之间，拇指压住管底部上侧面。
2．火焰灭菌接种环。
3．以右手小指与手掌拔取棉塞（如同时持有两管，可用小指与无名指拔取另一棉塞），将管口迅速通过火焰l～2次。
4．将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取少许菌，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。
37℃孵箱中培养18～24小时即可观察结果。
（三）液体接种法肉汤、胨水、发酵管等均系液体培养基。
用于增菌，观察细菌生长现象和检测细菌的生化反应等。
1．持好菌种管及培养基管。
2．灭菌接种环，由菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使接种物充分混合于培养基的液体中。
3．液体培养一般以18～24小时观察生长特征为好。
（四）穿刺接种法试管内半固体培养基采用此法接种，多用于保存菌种、观察动力及做厌氧培养等。
亦可用于观察细菌的某些生化反应。
1．持好菌种管和培养基管。
2．以灭菌接种针从菌种管取菌。
3．接种针直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达管底部（深入培养基3/4处）或沿管壁刺入（醋酸铅高层），接种后接种针应沿原路退出。
4．经培养后即可观察结果。
沿穿刺线生长，线外的培养基清亮者表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊者表示细菌有动力。
七、培养法根据培养目的和细菌的种类选用最适宜的培养方法。
常用的有一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。
（一）一般培养法一般培养法系指需氧菌或兼性厌氧菌等在需氧条件下的培养方法，故又称需氧培养法。
将已接种好的置37℃孵箱中培养18～24小时。
但标本中菌量很少或难于生长的细菌（如结核分技杆菌）需培养3～7天甚至l个月才能生长。
（二）二氧化碳培养法某些细菌的培养，需要5～10%二氧化碳环境中培养才能生长良好。
可采用二氧化碳孵箱，它能自动调节二氧化碳的浓度和温度，使用极为方便。
传统的方法则采用烛缸法，将培养基放入缸内，点燃蜡烛放在缸中，加盖（涂以凡士林）密闭。
因燃烧而产生CO2大约占5～10%，基本可满足细菌培养的要求。
（三）厌氧培养法厌氧菌标本的采集及运送有特殊的要求及注意事项，应避免正常菌群的污染，尽量少接触空气并立刻送检。
厌氧菌的培养法可大致分为：①物理学方法：遮断空气法（层积法）、真空法、空气置换法、厌氧罐培养、厌氧袋法、厌氧手套箱等。
②化学方法：焦性没食子酸法、硫乙醇酸钠法、黄磷燃烧法。
③生物学方法：需氧菌共生法、燕麦发芽法。
④混合法：真空或气体置换与焦性没食子酸法相结合，可根据实际情况选用。
