cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理

一分钟看懂基因编辑神器「Cre-LoxP」Q师弟小花师姐，我最近看到什么DO、DIO、FLEX系统的，据说都是Cre-LoxP系统，那么他们之间有什么差异啊？小花师姐师弟，要了解这三种系统的差异，我们首先必须先了解什么是Cre-LoxP系统。

Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能够控制基因组DNA中位点特异性重组的发生，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，可达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，其主要由Cre与LoxP两部分组成。

Cre是一种重组酶，于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。

Cre重组酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP 位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。

LoxP则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定了LoxP的方向。

LoxP位点的序列如下所示：其中，“N”表示可能变化的碱基。

通过高通量筛选，我们获得了不同的LoxP序列，如下表所示：不同LoxP位点序列表那么当Cre与LoxP相遇时，他们之间又将发生怎样的故事，使得Cre-LoxP系统名气大振呢？主要有以下三种情景哦~✫情景一当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（图1A）；✫情景二当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列（图1B）；✫情景三当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre 重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位（图1C）。

图1 Cre-LoxP系统基本工作原理示意图However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，A、B、C三种场景的变化其实是可逆的，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到一种稳定状态。

条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。

这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。

这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。

此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。

1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。

该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。

这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。

②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。

任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。

Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。

基因敲除实验原理基因敲除，听起来是不是超级酷？就像是在基因的世界里当一个小小的“建筑师”，把某个我们不想要的“小零件”给去掉呢。

咱先说说基因是啥吧。

基因就像是生物体内的一本超级复杂的“说明书”，里面写满了各种各样的指令。

这些指令告诉细胞该怎么生长、怎么工作、怎么和其他细胞打交道。

每个基因都有自己的任务，就像一个大家庭里的每个成员都有自己的活儿要干。

那基因敲除呢，简单来说，就是想办法让这个基因“罢工”。

怎么让它罢工呢？这就用到了一些很巧妙的方法。

有一种常见的方法就像是“狸猫换太子”。

科学家们会构建一个特殊的DNA片段。

这个片段呀，和我们想要敲除的基因长得很像，但是又有点不一样。

这个特殊的DNA片段就像是一个“冒牌货”。

然后呢，细胞里面的一些机制就会被这个“冒牌货”给骗了。

细胞会以为这个“冒牌货”就是它原本的那个基因，然后就会发生一些神奇的事情。

这个“冒牌货”会和细胞里面的一些酶呀之类的东西相互作用，最后导致原本的那个基因被破坏掉，就像把一个精密仪器里面的一个关键小零件给弄坏了一样，这个基因就没办法正常工作啦。

还有一种方法呢，就像是给基因使个“绊子”。

科学家们会利用一些特殊的技术，比如说像CRISPR - Cas9系统。

这个系统就像是一个超级精准的“小剪刀”。

这个“小剪刀”可以在基因的特定位置上进行切割。

就像你拿着一把剪刀，准确地把一根绳子在你想要的地方剪断一样。

当这个基因被剪断之后呢，细胞自身会尝试去修复这个断裂的地方。

但是呀，在修复的过程中，就很容易出错，这样就会导致这个基因失去它原本的功能。

这就好比你把一个拼图的一块给剪掉了，然后再胡乱地拼回去，那这个拼图肯定就不完整，也没办法像原来那样好看和有用啦。

那为啥要做基因敲除实验呢？这里面的学问可大着呢。

比如说，我们想知道某个基因是不是和某种疾病有关系。

如果我们把这个基因敲除之后，发现生物出现了和这种疾病类似的症状，那我们就可以初步判断这个基因和这种疾病是有关联的。

基因敲除技术的原理与应用近年来，基因编辑技术成为了生命科学研究的热门话题。

特别是基因敲除技术，它能帮助科学家研究基因的功能和生理病理过程，也能够为基因治疗提供一个新的方案。

本文将介绍基因敲除技术的原理、应用和限制，以期帮助大家更好地了解这项技术。

一、基因敲除技术的原理基因敲除技术是一种能够直接删除目标基因序列的技术，使得科学家能够研究从单个蛋白质到整个生物的对目标基因的依赖。

基因敲除技术一般分为两种类型：基于RNA干扰技术的基因敲除和基于基因编辑技术的基因敲除。

1.基于RNA干扰技术的基因敲除RNA干扰的基本原理是通过合成的小干扰RNA (siRNA) 来降低目标基因的表达水平。

siRNA 分子是一段短链 RNA，具有相互互补的特异性序列，能够在胞质中结合到核酸酶所介导的靶标mRNA上，从而切断相应的 mRNA。

当siRNA 切断某个基因的全部mRNA后，该基因就会在细胞中被敲除。

这种敲除方式有许多优点，其中最重要的是方法简单、快捷方便。

它比其他方法更适用于一些领域，例如在体内或体外实验中敲除某些基因，以及分子驱动实验中的高通量筛选等计划。

此外，RNA干扰技术可应用于许多不同的细胞、动物和植物模型，因此在基因功能研究、药物靶点鉴定和基因治疗等方面都是极具潜力的。

2.基于基因编辑技术的基因敲除基于基因编辑技术的基因敲除是一项更加复杂和精确的技术，可以通过针对相应的DNA序列进行直接编辑，产生与RNA干扰相似的效果。

这种技术消除了RNA干扰技术存在的一个显著缺点，即由于只降低基因的表达水平，可能会导致未知的抑制剂的产生，从而影响细胞其他基因的表达和功能。

通常，有三种编辑工具可用于基因编辑的敲除效果：锌指核酸修饰、TALEN和CRISPR/Cas9。

前两者被视为传统的编辑方式，而后者是一种更新、更现代的方法，由于其简单、快捷、多能且高效而色校名。

二、基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用非常广泛。

这种研究方法通常用于确定基因在宿主种的生存力、免疫反应、代谢过程、细胞周期、生长和治疗方案等领域的作用。

cre名词解释微生物CRE（的全称为Cre/loxP重组酶系统）是一种常用的遗传工程技术，被广泛应用于微生物学研究中。

本文将对CRE进行详细解释和探讨。

1. CRE的定义与原理CRE是一种重组酶系统，由Cre重组酶和loxP位点组成。

Cre重组酶是一种遗传物质（蛋白质），其功能是调控目标DNA分子上的重组反应。

loxP位点则是一种特定的DNA序列，它是CRE酶作用的靶标。

通过CRE和loxP的相互作用，可实现DNA分子的重组、插入或剪切等操作。

2. CRE的应用领域微生物学中，CRE被广泛用于基因组工程、基因表达调控、病毒病理研究等方面。

具体应用包括：- 基因敲除和基因突变：利用CRE的重组功能，可以靶向敲除或突变目标基因，从而实现研究该基因功能或解析其对生物体的作用。

- 基因表达调控：通过在目标基因上插入loxP位点，再利用CRE酶的活性，可以实现基因的激活或抑制，从而调控基因表达水平。

- 基因标记和追踪：结合荧光基因和CRE/loxP系统，可以标记特定细胞或组织，以追踪其在生物体内的分布和命运。

- 病原体研究：利用CRE/loxP系统，可以构建感染模型，研究病原体的致病机制、感染途径等，并探索相应的防治策略。

3. CRE的优势和局限性CRE/loxP系统在微生物学研究中具有以下优势：- 高度特异性：CRE酶对loxP位点的识别和结合具有高度特异性，因此可以实现准确的基因重组和操控。

- 灵活性：CRE/loxP系统可以在不同细胞类型和生物体中应用，且操作相对灵活，可以根据需要进行精细调整。

- 低毒性：CRE酶的表达对细胞或生物体的毒性较低，因此对被操作的生物体影响较小。

然而，CRE/loxP系统也存在一些局限性：- 依赖loxP位点：CRE/loxP系统必须在目标DNA上存在loxP位点才能发挥作用，因此需要在目标基因中进行插入或改造。

- 重组效率有限：CRE/loxP系统的重组效率受到多种因素的影响，包括CRE酶的表达水平、loxP位点的位置等，可能存在一定的不可控性。

《基因敲除的原理》基因敲除可以说是基因组学、细胞分离培养以及转基因技术的组合。

那么基因敲除的原理是什么呢？基因敲除的方法有哪些呢？在此，做个小结，以供大家学习。

一.概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。

二.实现基因敲除的多种原理和方法：1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，**证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson**建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中*普遍的使用方法。

(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，*常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。

主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。

所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。

嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。

一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。

二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。

免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。

在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。

三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。

基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。

首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。

下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。

Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。

它的鉴定主要根据毛色去鉴定。

注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。

【干货】诱导型条件性基因敲除介绍在上上上上次，我们为大家简单的介绍了Cre-loxP重组酶系统，知道了条件性基因敲除策略主要是基于Cre-loxP系统，并且还可以通过它来实现在特定组织细胞中or在动物的特定发育时期对目的基因敲除。

那么，如何随心所欲地实现时空上的条件性基因敲除呢？让我为您一一道来！条件性基因敲除小鼠首先，在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个Loxp序列，得到flox小鼠。

然后，将flox小鼠与带有组织特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

对于在特定组织细胞中的基因敲除，我们应该能够理解，主要取决于所选择的启动子。

利用组织特异性表达的启动子调控Cre重组酶的表达，就可以实现相应部位特定基因的敲除。

另外，某些启动子（即诱导型启动子）也可以受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用，如荷尔蒙诱导系统、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等。

这其中最频繁使用的是四环素系统（Tet-Off System/Tet-On System）和他莫昔芬系统（Tamoxifen System）。

四环素诱导的Cre-loxP系统四环素诱导的条件性基因敲除系统包含两个互补系统，tTA依赖（tetracycline-controlled transactivator protein (tTA) dependent）和rtTA依赖（reverse tetracycline-controlled transactivator protein (rtTA) dependent）的基因敲除系统，现在又称为Tet-Off系统和Tet-ON系统。

Fig.1 Tetracycline-inducible system[1](a) Tet-Off system. tTA is active without Dox (or tetracycline), and the gene of interest is expressed. With Dox (or tetracycline) treatment, tTA is inactivated, and the gene is no longer expressed.(b) Tet-On system. rtTA is inactive without Dox(or tetracycline), and the gene of interest is not expressed. With Dox (or tetracycline) treatment, rtTA is activated, and the gene is expressed.在这两个系统中，四环素（tetracycline）或其衍生物多西环素（强力霉素Dox）控制转录激活子tTA或rtTA与启动子Ptet结合，从而调控下游基因的表达。

利用Cre-Lox系统如何制备条件性敲除小鼠Cre-Lox系统的优势在于可以利用组织特异性启动子特异性控制Cre在特定组织的表达，以实现在特定组织细胞中对目的基因的敲除或改造，更好的规避全身敲除小鼠的胚胎致死现象。

1. Cre鼠的类型及应用为了更好的控制Cre重组酶的表达时间，通过使用具有雌激素受体的突变配体结合结构域的Cre融合蛋白（Cre-ERT），可以实现对Cre活性的时间控制，该蛋白可以通过他莫昔芬诱导而被激活[1]。

在无他莫昔芬诱导时，Cre-ERT融合蛋白与热激蛋白Hsp90结合，定位于细胞质中；当他莫昔芬给药诱导时，Hsp90脱离Cre-ERT融合蛋白，使Cre-ERT融合蛋白暴露核定位信号进入细胞核，发挥基因重组的作用[3]。

这一融合蛋白的介入相当于为Cre-Lox系统加装了一个由他莫昔芬控制的外源开关，使得体内基因编辑更具时空灵活性。

为了提升该系统的灵敏性、特异性，ER配体结合结构域被进一步突变为Cre-ERT2，该系统对他莫昔芬代谢活性物质4-羟基他莫昔芬（TAM主要通过肝脏的细胞色素P450酶代谢为活性产物4-OH-TAM）的敏感性提升了10倍[4]。

同样的，Cre-ERT2并非完美无暇，Poorva Sandlesh等人研究发现CreERT2-Lox系统在敲除SSRP1的应用中，存在效率过低问题[5]。

Cre鼠常用于与Flox小鼠杂交进行条件性的目的基因敲除，但也有研究将Cre鼠用于切割位于报告基因前的终止序列，以达到荧光标记特定细胞的目的，进一步研究细胞命运。

2. Flox鼠与Cre鼠的配繁在实际应用中，通过不同的Flox鼠与Cre鼠的配繁可以实现多种研究目的，通过组织/细胞特异性Cre鼠敲除特定组织/细胞群体的特定基因是最为常见的一种。

F0代与野生鼠互配获得F1代杂合子，F1代杂合子（flox/+）互配得到F2代纯合子（flox/flox），F2代纯合子（flox/flox）与全身/组织特异性工具鼠交配获得F3代（flox/+, Cre），F3代（flox/+, Cre）互配得到F4代（flox/flox, Cre），即cKO/cKI纯合子。

基因敲除技术的基本原理
基因敲除是自80年代末发展起来的一种分子生物学技术，是通过一定的途径使机体内特定的基因发生突变或缺失的技术，通过观察基因缺失引起的表型变化，进而推测该基因的生物学功能。

早期的基因敲除主要是利用DNA同源重组原理，通过设计同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

目前应用比较成功的基因敲除技术主要有：Zinc-finger、TALEN、CRISPR/Cas9。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-Associated)是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。

它是细菌和古细菌为应对噬菌体和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。

此系统的工作原理是通过人工优化的具有引导作用的单链gRNA(Guide RNA)引导核酸酶Cas蛋白在与gRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA双链断裂（DSB），进而利用生物体内非同源末端修复机制（NHEJ）或同源重组机制（HR）修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。

目前CRISPR/Cas9技术已经广泛应用于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、鱼类、微生物等各个领域。

基因敲除技术原理
基因敲除原理：gRNA识别并结合在目标基因区域引导Cas9蛋白对结合位点进行切割，引起DNA双链断裂（DSB），触发细胞自身的非同源末端修复机制（NHEJ），NHEJ修复的过程中往往会产生DNA 的插入或删除（Indel），造成移码突变，致使基因功能丧失，从而实现基因敲除。

1.4.1 乳酸菌基因敲除原理概述1980年左右，科学家研究出了一种非常有意义的生物学技术，也就是基因敲除技术。

它的技术原理是在特定的环境下，对指定的基因序列进行删除并修改染色体将细胞内所含的遗传信息改变。

这项技术的开发使得细菌正常反应和吸收过程发生变化，减少了多余新陈代谢物质的生成和发酵成本浪费，在某种水平上增加了产物的生产效率。

而且，其对于细菌结构的研究也有一定的帮助，如乳酸菌错误!未找到引用源。

经典基因敲除技术是利用DNA同源重组原理。

同源重组依赖于基因同源序列的结合，并且重组发生在DNA分子或分子内交换等价物之间。

根据同源重组原理，通过酶切连接和PCR等方法合理构建不同结构的重组载体，然后通过电转化等手段导入宿主细胞，实现宿主染色体DNA序列的片段缺失、定点突变或插入突变等。

乳酸菌中的同源重组是一个复杂的过程，通常分为四个阶段，即初始阶段、同源序列配对、同源片段交换和异源片段交换以及Holiday中间体的分离，其间需要RecA，RecBCD，RecF，RecR ，RuvAB等重要蛋白质的参与错误!未找到引用源。

此外，基于位点特异性重组，乳酸菌也可以进行敲除。

敲除的原理是在重组酶的催化下，两条DNA链将在特定位点进行重组。

根据特定位点的顺序和方向，重组后可能会出现三个结果：整合（integration），切除（excision），倒位（inversion）。

位点特异性重组酶由两个主要家族，整合酶系和解离酶系组成。

整合酶家族的两种代表性重组酶系统分别是Cre / loxP和FLP / FRT重组酶系统。

在解离酶家族中，乳酸菌中常用的重组酶是乳酸菌噬菌体TP901-1整合酶，其特异性介导attP位点与attB位点之间的重组反应。

1.4.2 乳酸菌基因敲除策略（1）利用同源重组单交换双交换进行敲除单交换和双交换同源重组的主要条件是构建重组载体，并利用PCR扩增靶基因的上游和下游片段或不完整的靶基因，将其连接到敲除载体，然后将其转化到宿主细胞中。