cre_loxp基因敲除系统教学文案

Cre鼠和loxp鼠繁殖策略
《Cre鼠和loxp鼠繁殖策略》
Cre鼠和loxp鼠是生物学家常用的基因编辑工具，它们的繁殖策略也是重要的研究内容。

Cre鼠是一种基因敲除动物，它的繁殖策略是先将其基因编辑，然后将其与普通小鼠进行
杂交，最后将杂交后的小鼠繁殖起来，从而获得纯种的Cre鼠。

Loxp鼠是一种可以控制基因的动物，它的繁殖策略是将其基因编辑，然后将其与普通小
鼠进行杂交，最后将杂交后的小鼠繁殖起来，从而获得纯种的Loxp鼠。

Cre鼠和Loxp鼠的繁殖策略相似，都是首先进行基因编辑，然后将其与普通小鼠进行杂交，最后将杂交后的小鼠繁殖起来，从而获得纯种的Cre鼠和Loxp鼠。

以上就是Cre鼠和Loxp鼠繁殖策略的基本介绍，它们的繁殖策略是生物学家研究的重要
内容，可以为生物学家在基因编辑研究中提供有用的参考。

四环素诱导基因敲除敲入技术服务详解Cre重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。

LoxP序列是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。

Cre在催化DNA 链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。

Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1.如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2.如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3.如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。

另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。

利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。

诱导性基因敲除以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。

常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。

Cre-LoxP图：该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为Tet―Off (tTA依赖)系统和T et―On (rtTA依赖)系统。

利用Cre-Lox系统如何制备条件性敲除小鼠Cre-Lox系统的优势在于可以利用组织特异性启动子特异性控制Cre在特定组织的表达，以实现在特定组织细胞中对目的基因的敲除或改造，更好的规避全身敲除小鼠的胚胎致死现象。

1. Cre鼠的类型及应用为了更好的控制Cre重组酶的表达时间，通过使用具有雌激素受体的突变配体结合结构域的Cre融合蛋白（Cre-ERT），可以实现对Cre活性的时间控制，该蛋白可以通过他莫昔芬诱导而被激活[1]。

在无他莫昔芬诱导时，Cre-ERT融合蛋白与热激蛋白Hsp90结合，定位于细胞质中；当他莫昔芬给药诱导时，Hsp90脱离Cre-ERT融合蛋白，使Cre-ERT融合蛋白暴露核定位信号进入细胞核，发挥基因重组的作用[3]。

这一融合蛋白的介入相当于为Cre-Lox系统加装了一个由他莫昔芬控制的外源开关，使得体内基因编辑更具时空灵活性。

为了提升该系统的灵敏性、特异性，ER配体结合结构域被进一步突变为Cre-ERT2，该系统对他莫昔芬代谢活性物质4-羟基他莫昔芬（TAM主要通过肝脏的细胞色素P450酶代谢为活性产物4-OH-TAM）的敏感性提升了10倍[4]。

同样的，Cre-ERT2并非完美无暇，Poorva Sandlesh等人研究发现CreERT2-Lox系统在敲除SSRP1的应用中，存在效率过低问题[5]。

Cre鼠常用于与Flox小鼠杂交进行条件性的目的基因敲除，但也有研究将Cre鼠用于切割位于报告基因前的终止序列，以达到荧光标记特定细胞的目的，进一步研究细胞命运。

2. Flox鼠与Cre鼠的配繁在实际应用中，通过不同的Flox鼠与Cre鼠的配繁可以实现多种研究目的，通过组织/细胞特异性Cre鼠敲除特定组织/细胞群体的特定基因是最为常见的一种。

F0代与野生鼠互配获得F1代杂合子，F1代杂合子（flox/+）互配得到F2代纯合子（flox/flox），F2代纯合子（flox/flox）与全身/组织特异性工具鼠交配获得F3代（flox/+, Cre），F3代（flox/+, Cre）互配得到F4代（flox/flox, Cre），即cKO/cKI纯合子。

条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。

CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。

Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。

loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。

（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。

）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。

带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。

在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。

loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。

Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。

Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。

（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。

在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。

兰翀 等/利用Cre/LoxP 系统删除转基因山羊体内的选择标记基因Chinese Journal of Biotechnology December 25, 2013, 29(12): 1847−1854 /cjbcn©2013 Chin J Biotech, All rights reservedReceived : March 10, 2013; Accepted : August 2, 2013Supported by : Program of Shanghai Technology Chief Scientist (No. 11XD1422000), Shanghai Technique Innovative Plan (No. 11431921400), Shanghai R&D Base Construction Projects (No. 10dz2251700).Corresponding author : Siguo Liu. Tel: +86-21-51380637; Fax: +86-21-58951012; E-mail: lsg@ *These authors contributed equally to this study.上海市科技术带头人 (No. 11XD1422000)，上海市“科技创新行动计划” (No. 11431921400)，上海市科委研发基地建设项目 (No. 10dz2251700) 资助。

网络出版时间：2013-10-09 网络出版地址：/kcms/detail/11.1998.Q.20131009.1942.001.html生物工程学报利用Cre/LoxP 系统删除转基因山羊体内的选择标记基因兰翀1,2*，任丽娜2*，吴敏1,2，刘思国2，刘国辉2，徐旭俊2，陈建泉2，马恒东1， 成国祥21 四川农业大学动物遗传育种研究所，四川 雅安 6250142 上海转基因动物育种与制药工程技术研究中心 上海杰隆生物工程股份有限公司，上海 201210兰翀, 任丽娜, 吴敏, 等. 利用Cre/LoxP 系统删除转基因山羊体内的选择标记基因. 生物工程学报, 2013, 29(12): 1847−1854.Lan C, Ren LN, Wu M, et al. Deletion of marker gene in transgenic goat by Cre/LoxP system. Chin J Biotech, 2013, 29(12): 1847−1854.摘 要: 在制备转基因家畜过程中的一个关键步骤是使用选择标记基因 (Selectable marker genes ，SMGs) 将转基因整合细胞从大量的正常细胞中筛选出来，这导致了SMGs 整合入家畜的基因组内持续传递给后代。

基因敲除的技术和应用随着现代生命科学技术的发展，人们逐渐感受到基因敲除技术的强大和对于生命科学研究的深刻影响。

基因敲除是一种迅速且精准的基因表达抑制技术，其引起的基因失活可以为许多生物学问题提供重要答案。

本文将介绍基因敲除技术的原理及其应用。

基因敲除技术的原理基因敲除（Gene Knockout）是通过基因转染、体外转录、酶联反应以及基因编辑等手段，将物种基因组DNA序列的一部分或全部突变或删去，以制造失活变异体，实现基因靶点的消除，从而破坏目标基因的功能。

这种技术需要在实验室内精准选择目标基因（受体、信号通路等）并引入外源DNA分子，以制造一定的突变或完全失活的生理状态。

国际上常用的基因敲除系统有Cre-LoxP系统、Flippase （Flp）/FRT系统、Tet-On/Tet-Off系统、RNAi系统等。

Cre-LoxP系统是基于一个菌群住在肠道内的细菌切割酶的作用。

LoxP位点为34个碱基的DNA序列，Cre为双链酶，可以识别该位点，同时发挥切割酶和粘接酶的作用，形成“切掉”或“加入”等效果，从而达到改变目标基因DNA序列的目的，进而实现基因敲除的作用。

而Flippase（Flp）/FRT系统则是以酵母菌的响应元件FRT为基础。

在这个系统中，与Cre-LoxP系统类似的重新组合酶Flp可以切割、粘接两个FRT位点，使相邻的基因模块（例如启动子和融合基因）被分离，实现目标基因失活。

Tet-On/Tet-Off系统则是利用反转录病毒的基因表达特性，通过快速手段改变靶向基因表达。

该系统中，编码反向反而使靶向基因表达迅速发生变化，在短时间内实现基因敲除，并进一步研究变化造成的生物学效应。

RNAi系统则是通过RNA 干扰技术实现目标基因敲除。

其中，siRNA技术主要包括设计合适的RNA序列，然后将其导入到靶向基因的mRNA中，促成靶向基因的特定片段丧失其生物学功能，达到敲除目标基因的目的。

基因敲除技术的应用基因敲除技术主要应用于以下两个方面：1.生命科学研究基因敲除技术在生物医学、基础研究和农业等领域的应用非常广泛。