仪器分析-高效液相色谱法

第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。

高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。

梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。

也称为梯度淋洗。

低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。

它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。

高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。

它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。

两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。

柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。

柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。

液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。

K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。

液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。

分配系数较大的组分保留值也较大。

正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。

反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。

化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。

仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。

本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。

HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。

相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。

HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。

其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。

HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。

2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。

3.将稀释后的溶液注入进样器中。

4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。

柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。

5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。

6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。

7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。

HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。

例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。

在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。

在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。

总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。

由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。

高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。

2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。

3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。

4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。

5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。

6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。

反之称为反相色谱。

7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。

8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。

9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。

二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。

（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。

（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。

（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。

（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。

（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。

（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。

（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。

（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。

高效液相色谱法(HPLC) 是在气相色谱和经典液相色谱的基础上，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。

特点：高压、高柱效、高灵敏度2.HPLC中分离条件的选择：a.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm)首选化学键合相，匀浆法装柱b.流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相c.柱温的选择:选室温25-30℃左右。

太低流动相黏度增加，太高容易产生气泡第一节液-固色谱法1.液-固色谱法是利用各组分在固定相上的吸附能力不同进行分离的，也称液-固吸附色谱。

2.分离原理.：组分分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面活性中心，靠组分分子的分配比不同而分离。

3.吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及流动相的性质等。

1）组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附;2）组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。

吸附色谱是分离几何异构体的有效手段;不同的官能团具有不同的吸附能力，因此，吸附色谱可按族分离化合物4.固定相：常用的液-固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。

一般采用5~10μm的全多孔型微粒。

这些吸附剂的极性都比较大，对非极性组分的保留能力较弱，与极性化合物的相互作用较强。

5.流动相：在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。

液-固色谱的流动相必须符合下列要求:1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。

2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。

3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。

4）应与所用检测器相匹配。

例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。

5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜。

第二节化学键合相色谱法1.液液分配色谱法分离原理：根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，在两溶液间进行不同分配而实现分离。

仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。

它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。

仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。

流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。

高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。

与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。

同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。

因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。

在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。

通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。

例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。

在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。

通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。

在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。

通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。

在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。

第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。

目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。

B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。

C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。

4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。

（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。

5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。

§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。

现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。