内源性生物素清除液(1×)

免疫组化,免疫检测北京华越洋生物-----------------------------------------------DMDC玻片硅化剂(2%) 100ml 免疫组化40% 室温,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由二甲二氯硅烷(DMDC)组成。

玻片硅化试剂盒(APES法) 3×100ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。

玻片硅化试剂盒(APES法) 3×500ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。

PBS-Triton去污剂100ml 免疫组化40% 室温,12个月去污主要由PBS、Triton-100组成。

Sorensen磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH5.3-8.04)500ml 免疫组化40% 4℃,6个月组织化学常用缓冲液主要由磷酸二氢盐(钠/钾)和磷酸氢二盐(钠/钾)溶液组成,按不同比例混合后获得对用PH值。

pH值可选5.3，5.6，5.91，6.24，6.47，6.64，6.81，6.98，7.17，7.73，8.04。

Sorensen磷酸缓冲液(1×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度17mM。

Sorensen磷酸缓冲液(10×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度170mM。

TBS缓冲液(0.02mol/L,pH8.2) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠组成。

TBS缓冲液(0.05mol/L,pH7.4) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠、叠氮钠、BSA组成。

全套小鼠ELISPOT辅助试剂盒ALL-IN-ONE Mouse ELISPOT Accessory Kit说明书Cat#:2230014产品描述：ELISPOT辅助试剂包括：Magi Coating Buffer、Blocking Stock Solution R、Dilution Buffer R、Washing Buffer、AEC显色液。

方便广大ELISPOT客户的使用。

使用前请对照表(1)检查试剂组成成份，若有任何疑问请与深圳市达科为生物工程有限公司联系。

表(1)ELISPOT辅助试剂盒组成使用说明：1.Magi Coating Buffer(1×)：即用型，用于未包被PVDF膜的预湿，用时15μL/孔，预湿1分钟，扣去孔内液体即可进行包被。

2.Blocking Stock Solution R(10×)：封闭缓冲液，用无菌PBS稀释(1:10)即为工作液，用于已包被固相载体上的非特异性结合位点的封闭。

用法：包被完成后，扣去包被液，用无菌PBS洗涤3次(200μL/孔)，以200μL/孔加入封闭缓冲工作液，室温封闭2小时或37°C封闭1小时。

3.Dilution Buffer R(10×)：用1×无菌PBS稀释(1:10)即为工作液，用于生物素标记的抗体(Biotinylated Antibody，Secondary Antibody)及酶联亲和素(Streptavidin-HRP)的稀释。

4.Washing Buffer(50×)：洗涤液，用蒸馏水稀释(1:50)即为工作液，用时260μL/孔，每次洗涤5-7遍。

5.AEC Coloring System：显色系统，用前按顺序取用AEC Dilution、AEC SolutionⅠ(20×)、AECSolutionⅡ(20×)、AEC SolutionⅢ(200×)配制，取用比例为180:10:10:1。

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策良好的免疫组化染色切片是正确推断染色结果的基础和前提。

由于免疫组化染色过程中存在许多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件特别简单的事。

需要病理技术员和病理医生亲密协作、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。

虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和"杂音'染色片（有阳性信号）。

一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。

这是常规工作中比较常见的现象，消失这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有消失问题，组织或细胞的确不表达与抗体相关的抗原。

2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。

假阴性结果又可分为两种状况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。

消失这种状况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。

获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。

由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不行缺少的作用。

（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。

比如，组织未进行抗原修复，有的组织必需经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个渐渐的过，但间或也遇到突然失效的状况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的缘由。

也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如遗忘加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

为了避开这种简洁的错误，有一种简洁的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观看是否消失棕色。

假如消失了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。

假如这种DAB再滴到切片上没有消失任何阳性信号，问题肯定是出在三抗以前。

免疫组织化学技术制片的规范和质量控制随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。

科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。

影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。

因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。

一、免疫组织化学技术对组织切片的要求免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。

冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。

因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。

二、组织的固定组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。

常用的固定液为10％福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。

固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。

冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。

三、载玻片的处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。

较常用效果较好的是硅化玻片。

硅化玻片的制备：1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。

2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。

3. 无水丙酮液浸1-2min。

3. 蒸馏水浸洗1-2min。

4. 烤干备用。

可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。

＊ APES(3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷SIGMA产品。

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。

2. 水浴锅。

（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。

4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。

5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。

8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。

（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤：
1.石蜡切片脱蜡至水化。

2.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

3.蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。

4.5~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃。

5.PBS冲洗，5分钟×3次。

6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

7.PBS冲洗，5分钟×3次。

8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

9.PBS冲洗，5分钟×3次。

10.显色剂显色（DAB或AEC）。

11.自来水充分冲洗，复染，封片。

12.冰冻切片免疫组化染色步骤。

13.冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分
钟，PBS洗，5分钟×3.用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×2。

自然杀伤细胞分泌干扰素γ促进乙肝病毒的清除胡辛;胡春松;黄保军【摘要】Objective To investigate the mechanism of NK cell in eliminating the Hepatitis B virus during HBV in-fection . Methods Acute HBV infection model was established by injecting adult mice hydrodynamically with 20μg of pGEM4Z/HBV1. 2 plasmid. This model was evaluated by detecting serum level of HBsAg and HBcAg in liver tis-sue at the indicated time points by radioimmunoassay and immunohistochemistry respectively. The variation of fre-quency and absolute number of NK cell was analyzed between wide type ( WT ) mice and HBV plasmid-injected mice. Furthermore, the activation and the IFN-γproduction of NK cell were investigated in these mice by flow cy-tometry. HE staining and alanine transaminase( ALT) dectection were used to observe liver injury. To test whether NK cell and IFN-γwere involved in HBV elimination, we usedPK136 antibody to clear NK cell and IFN-γneutral-ization antibody toblock IFN-γeffect. Results After the hydrodynamic injection with 20 μg ofpGEM4Z/HBV1.2, the serum level of HBsAg and expression of HBcAg in liver tissue were very high at 1 week, but then decreased gradually. However, these antigens almost became negative at 4 to 5 weeks, which mimic acute HBV infection pa-tients. Compared with NK cell from WT mice, the frequency and absolute number of NK cell increased significantly from HBV mice. Also, the NK cells express higher level of CD69 and produce more IFN-γ. Meanwhile, there was no liver injury in HBV mice. Depletion ofNK cell or blocking IFN-γ effe ct in HBV mice could significantly in-crease the level of HBV related antigens. Conclusion In the mouse model of acute HBV infection, NK cell could promote the HBV elimination through secreting IFN-γ.%目的探讨自然杀伤细胞(NK)在乙型肝炎病毒(HBV)清除过程中的作用机制.方法通过对成年小鼠高压注射20μg pGEM4Z/HBV1.2质粒建立HBV急性排斥小鼠模型,采用放射免疫试剂盒定量检测不同时间点(1、2、3、4、5周)小鼠血清中HBsAg、免疫组化检测肝脏组织中HB-cAg来评估模型的建立.流式细胞术分析对照小鼠和HBV小鼠肝脏中NK细胞比例和绝对数量变化,进一步分析两种小鼠NK细胞活化情况和分泌干扰素(IFN)-γ的能力变化.通过肝脏组织切片HE染色以及谷丙转氨酶检测判断小鼠肝脏损伤状况.最后,通过PK136抗体清除小鼠NK细胞以及IFN-γ中和抗体进一步证实NK细胞分泌的IFN-γ是否参与HBV 的清除过程.结果小鼠高压注射20μg pGEM4Z/HBV1.2质粒后,第1周血清中HBsAg和肝脏组织中HBcAg表达量都较高,但呈降低趋势,在4~5周后几乎转阴,很好地模拟了临床上急性感染HBV的病例.与对照组相比,HBV小鼠肝脏中NK细胞比例和绝对数量明显增高;进一步研究显示HBV小鼠NK细胞活化分子CD69表达也显著上升,同时IFN-γ分泌增加.与此同时,小鼠肝脏呈无损伤状态.预先清除NK 细胞或阻断IFN-γ 的功能能显著增加HBV小鼠中相关抗原的含量,延缓HBV的排斥.结论在HBV急性排斥模型中,NK细胞通过分泌IFN-γ促进HBV的清除.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2017(052)002【总页数】6页(P215-220)【关键词】HBV;NK细胞;IFN-γ【作者】胡辛;胡春松;黄保军【作者单位】安徽医科大学基础医学院免疫教研室,合肥 230032;安徽医科大学基础医学院免疫教研室,合肥 230032;安徽医科大学基础医学院免疫教研室,合肥230032【正文语种】中文【中图分类】R392.12乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) 是危害全球的重大传染性疾病[1]，全球约有3.5亿人感染HBV。