无菌检查微生物限度检查方法学验证实例

盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证作者：吴羽岚嵇海澄来源：《中国医药科学》2013年第13期[摘要] 目的对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法进行探讨，建立其无菌检查方法。

方法按《中国药典》（2010年版）附录ⅪH无菌检查方法进行。

结果在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。

结论可以采用此法对本品的无菌进行检查。

[关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法[中图分类号] R-331 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）13-95-02Study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection WU Yulan JI HaichengJiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.Ltd.，Lianyungang 222000，China[Abstract] Objective To discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. Methods The test were done according to appendix XIH-sterile examination method in"Chinese Pharmacopeia"（2010 edition）. Results The method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. Conclusion This method can be used for the sterile examination of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection.[Key words] Levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection；Sterile examination method；Membrane-filter procedure盐酸左氧氟沙星（Levofloxacin Hydrochloride）化学名称：（S）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并嗪-6-羧酸盐酸盐的水合物，属第三代喹诺酮类抗菌药。

速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。

2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。

（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。

b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。

c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。

d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。

4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。

微生物限度检查检验方法验证报告
方案编制年月日方案审核年月日方案批准年月日
上海美宝生命科技有限公司
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7.1试验样品
确认人：日期：
7.2 产品试验组微生物生长情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.6稀释剂对照组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：7.7 试验组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：
7.8 结果说明
经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。

稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。

7.9 结论
以上验证结果证明，本品（适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。

附录。

微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。

（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。

（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。

（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。

三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。

上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。

用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。

熊胆粉微生物限度检查方法学验证目的建立熊胆粉微生物限度检查方法，并对方法进行验证。

方法采用《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法对熊胆粉进行微生物限度检查。

结果用pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品，可采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）进行细菌计数；采用培养基稀释法（400 mL 营养肉汤）进行沙门菌检查；采用1∶10供试液的常规法进行霉菌及酵母菌计数和控制菌检查。

结论该方法消除了样品的抑菌性，可用于该品种的微生物限度检查。

[Abstract] Objective To set up the microbial limit test ways for bear gall powder and verification of the method. Methods A microbial limits method of Chinese Pharmacopeia (2010 edition) part one appendix ⅩⅢC was used to detected the microbial limit test method of bear gall powder. Results Sodium chloride-peptone aseptic buffer solution (pH=7.0) was used to prepare the test sample. Culture media dilution (1∶20 sample solution, 0.1 mL/dish) was used to count the bear gall powder bacteria. Salmonella test method for culture media dilution method (400 mL NB) was used. 1∶10 selected liquid was adopted to do the mildew and yeast count and control bacteria inspection by the conventional method. Conclusion This method can eliminate the antimicrobial properties and it can be used for the microbial limit test for bear gall powder.[Key words] Bear gall powder; Microbial limit test; Validation熊胆粉为熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，收载于国家药品标准《新药转正标准》第11册[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度檢查一直采用常规方法检验，根据《中国药典》2010年版的要求，对原用的常规方法进行验证[3]。